Saggi biochimici per la valutazione dell’attività di ligandi in linee cellulari Il ciclo cellulare è composto fondamentalmente da due parti: l’interfase e la mitosi. Interfase Fase G1: sintesi dei componenti cellulari Fase S: duplicazione del materiale genetico Fase G2: sintesi dei materiali necessari alla successiva mitosi.

Il processo mitotico è costituito da 4 fasi:Profase, Metafase, Anafase, Telofase

Le cellule normali non hanno la capacità di proliferare indiscriminatamente a causa di alcuni geni ubiquitari ad azione repressiva: p53 e Rb. Il gene p53 viene così chiamato in quanto codifica per una proteina di 53 kDa associata alla cromatina e alla matrice nucleare di cellule normali e tumorali. La sua entrata nel nucleo è mediata da proteine chaperon in particolare la Hsp70 (heat shock protein).

Il gene p53 viene considerato un tumor suppressor gene in quanto la sua attività è in grado di arrestare la progressione del ciclo cellulare nella fase G1, favorendo la riparazione del DNA danneggiato. A questo punto si aprono due possibilità: se la riparazione è produttiva il ciclo cellulare può riprendere e la cellula sopravvive; nel caso in cui il danno sia irreparabile, p53 promuove l’apoptosi della cellula.

Se la riparazione non ha successo s’innesca il meccanismo di apoptosi La proteina p53 è una DNA-binding protein in grado di riconoscere un motivo simmetrico di 10 bp e di attivare la trascrizione dei geni. Se la riparazione non ha successo s’innesca il meccanismo di apoptosi Fas L’innesco dell’apoptosi può avvenire mediante attivazione ligando Fas-L con il suo recettore Fas. Il recettore Fas è una proteina presente sulla membrana plasmatica appartenente alla famiglia dei recettori del TNF-NGF. Quando lega il suo ligando induce apoptosi:

Nell’uomo i processi apoptotici sono coinvolti in: - sviluppo embrionale - sviluppo del sistema nervoso centrale - atrofia tissutale endocrino-dipendente - turn-over cellulare In numerosi processi patologici, quali infezioni virali (AIDS), tumori, e malattie autoimmuni, una deregolazione dell’apoptosi può essere la base o una delle cause della patogenesi della malattia.

Induzione dell’apoptosi - radiazioni ionizzanti - legame del recettore Fas con il suo ligando Fas-L (vedi percorso 1 e percorso 2) - rimozione dal mezzo di coltura dei fattori di crescita - riduzione della disponibilità di ATP - aumento di Ca++ citoplasmatico

percorso 1 dopo il legame si ha oligomerizzazione del recettore Fas che provoca il reclutamento di proteine citosoliche FADD/MORT ad attività adattatrice; su queste proteine si aggancia la caspasi 8 che attiva a cascata le altre caspasi fino alla caspasi 3 la quale produce idrolisi dei substrati citosolici e nucleari.

percorso 2 L’interazione recettoriale porta all’attivazione di una fosfolipasi C specifica per la fosfatidilcolina e di una sfingomielinasi acida. Dall’idrolisi della sfingomielina si generano i ceramidi i quali inducono apoptosi nelle cellule emopoietiche mediante il ganglioside GD3. L’apoptosi da GD3 sembra agire a valle delle caspasi in quanto non può essere bloccata da inibitori specifici delle caspasi.

percorso 3 (mitocondriale) La caspasi 8 ha come substrato il bid (BH3 interacting domain death agonist). Il prodotto di idrolisi del bid indicato come t-bid entra nei mitocondri e genera oligomerizzazione dei fattori pro-apoptotici Bax e Bak che portano alla fuoriuscita dal mitocondrio del citocromo c che è il cofattore dell’APAF-1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1) che attiva la caspasi 9 che poi porta all’attivazione della caspasi 3 e al taglio dei substrati cellulari. Fattori pro-apoptotici: bax, bad, bak Fattori antiapoptotici: bcl-2, bcl-xL

L’apoptosi può essere indotta da ligandi che interagendo su recettori specifici portano all’innesco in seguito ad aumento di Ca++ citoplasmatico. La caratterizzazione di questi recettori, la loro funzione regolatrice all’interno della cellula costituisce un metodo di valutazione dell’attività di ligandi verso questi recettori.

Monitoraggio dell’apoptosi Studio Citotossicità Dosaggio LDH LDH Lattato Piruvato NAD NADH 560 nm Resorufina Resazzurina Diaforasi 590 nm

Dosaggio delle Caspasi Cysteinyl Aspartate Specific Proteinases Colorimetrico Fluorimetrico Le caspasi sono delle cisteino-proteasi in grado di tagliare i substrati dopo un residuo di aspartato. Attualmente sono note 10 tipi di caspasi e la più studiata è la caspasi 3. La caspasi 3 è normalmente presente in forma inattiva, come pro-caspasi la quale proteoliticamente viene attivata.

La caspasi 3 è in grado di tagliare il poli-ADP-ribosio-polimerasi (PARP) un enzima coinvolto nella riparazione del DNA. Dalla mappatura del sito di taglio del PARP è stato identificato un tetrapeptide DEVD come sito dell’attività caspasica. La coniugazione del DEVD con un residuo colorimentrico o fluorimentrico costituisce il substrato per il dosaggio della caspasi presente.

Attivazione della caspasi1 Induzione di apoptosi Attivazione della caspasi1 DEVD-pNA DEVD-AFC caspasi3 DEVD DEVD -pNA -AFC rivelazione colorimetrica rivelazione fluorimetrica pNA = p-nitroanilide ; AFC = 7-ammino-4-trifluorometilcumarina

Dosaggio della Annexina V L’annexina V è una proteina con forte attività anticoagulante che ha elevata affinità calcio-dipendente per amminofosfolipidi. La fosfatidilserina è localizzata dalla parte interna della membrana cellulare, mentre mediante trasporto attivo durante l’apoptosi viene a trovarsi sul lato esterno della membrana cellulare. L’annexina V in presenza di Ca++ ha elevata affinità per la fosfatidilserina.

Legando all’annexina V un residuo fluorescente come il fluorescein isotiocianato (FITC) è possibile misurare la quantità di fosfatidilserina presente sul lato esterno della membrana cellulare. citoplasma FICT Annexina V Ca++ fosfatidilserina esterno interno

bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio mitocondrio MTT (giallo) Formazano MTT Colore (azzurro)