Quali sono gli strumenti a disposizione dell’istologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

ordine di grandezza delle strutture di interesse istologico in questo corso raramente ci soffermeremo sulle esatte dimensioni delle strutture oggetto di studio è però di fondamentale importanza conoscere l’ordine di grandezza di tali strutture

Cosa significa “ordine di grandezza”? Semplificando: due oggetti differiscono di un ordine di grandezza quando uno è circa 10 volte più grande dell’altro

Importanza degli ordini di grandezza quale sarebbe l’esito di questo incidente?

può una proteina attraversare la membrana tramite un canale ionico?

scale lineari e scale logaritmiche 80 mm 70 mm 60 mm 50 mm 40 mm 30 mm 20 mm 10 mm 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å In una scala logaritimica, il valore di ogni suddivisione si ottiene moltiplicando (o dividendo) il valore della suddivisione precedente. In questa scala, il fattore è 10

Questione di dimensioni… 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å spessore di un capello umano cellule epiteliali globuli rossi batteri le frecce bianche indicano l’ordine di grandezza di alcune strutture biologiche e chimiche virus proteine aminoacidi atomi

immagine istologica - l’organismo è composto di cellule - esistono molti tipi diversi di cellule L’organismo è composto di cellule; esistono molti tipi diversi di cellule, e nell’organismo si osserva tipicamente che cellule relativamente simili fra loro si aggregano, formando i cosiddetti tessuti. L’istologia è lo studio dei tessuti dell’organismo. Questo preparato istologico mostra diversi tessuti.

immagine istologica L’organismo è composto di cellule; esistono molti tipi diversi di cellule, e nell’organismo si osserva tipicamente che cellule relativamente simili fra loro si aggregano, formando i cosiddetti tessuti. L’istologia è lo studio dei tessuti dell’organismo. Questo preparato istologico mostra diversi tessuti. tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano … …formando i cosiddetti tessuti. L’istologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dell’organismo

immagine istologica cosa si osserva? L’organismo è composto di cellule; esistono molti tipi diversi di cellule, e nell’organismo si osserva tipicamente che cellule relativamente simili fra loro si aggregano, formando i cosiddetti tessuti. L’istologia è lo studio dei tessuti dell’organismo. Questo preparato istologico mostra diversi tessuti.

Anatomia del microscopio ottico o “luce”

schema di funzionamento di un moderno microscopio ottico bx51 interior

come si ottiene, a partire da tessuti biologici, un’immagine come questa? immagine istologica L’organismo è composto di cellule; esistono molti tipi diversi di cellule, e nell’organismo si osserva tipicamente che cellule relativamente simili fra loro si aggregano, formando i cosiddetti tessuti. L’istologia è lo studio dei tessuti dell’organismo. Questo preparato istologico mostra diversi tessuti.

La preparazione di materiale istologico Problema 1 la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

microtomo a slitta

microtomi elettronici

La preparazione di materiale istologico Problema 2 i tessuti biologici sono per lo più molli prima del taglio, il tessuto deve essere indurito Fissazione con aldeidi Inclusione Congelamento

criostato

La preparazione di materiale istologico Problema 3 i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

acidofilia e basofilia le sostanze acide che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti basici (basofilia) le sostanze basiche che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (acidofilia o eosinofilia)

diversi tipi di granulociti acidofilo (eosinofilo) diversi tipi di granulociti basofilo neutrofilo

sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica fissazione di un campione di tessuto in formaldeide congelamento del pezzo taglio al microtomo montaggio su vetrino “bagni” in soluzioni di coloranti disidratazione e coverslipping

lo striscio di sangue Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

striscio

Istologia “funzionale” Colture cellulari Coloranti vitali Istochimica Immunoistochimica Immunofluorescenza Tecniche speciali Traccianti assonali Tecniche combinate L’istologia moderna non si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su specifici correlati funzionali della composizione di un tessuto Negli esempi che abbiamo visto fin’ora, l’osservazione si limita agli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. L’istologia pero’ diventa molto piu’ interessante quando si pone come obiettivo quello di rispondere a quesiti su specifici correlati funzionali della composizione di un tessuto.

Citochimica e Istochimica L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti Mentre nella biochimica tradizionale il materiale biologico viene studiato tipicamente “in provetta”, la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su sezioni di tessuto, consentendo di identificare i costituenti in situ.

Immunofluorescenza e immunoistochimica Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)

immagine istologica L’organismo è composto di cellule; esistono molti tipi diversi di cellule, e nell’organismo si osserva tipicamente che cellule relativamente simili fra loro si aggregano, formando i cosiddetti tessuti. L’istologia è lo studio dei tessuti dell’organismo. Questo preparato istologico mostra diversi tessuti. che livello di dettaglio si apprezza in questa immagine?

stesso tessuto a maggiore ingrandimento

ulteriore ingrandimento... è sufficiente il microscopio ottico a “saziare” ogni curiosità sulle strutture viventi?

Questione di dimensioni… 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å Occhio umano cell. epiteliali globuli rossi batteri Microscopio ottico virus le frecce indicano il massimo potere risolutivo di alcuni strumenti di osservazione proteine aminoacidi atomi

Che differenza c’è fra: ingrandimento e potere di risoluzione?

Questo è quello che succede quando si ingrandisce indefinitamente un’immagine.

Aumentare a piacimento la risoluzione di un’immagine già acquisita è possibile solo nei film americani...

il potere risolutivo dello strumento di osservazione determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine. L’ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini

di conseguenza, l’ulteriore ingrandimento di questa immagine non rivela maggiori dettagli

il microscopio elettronico a trasmissione per fortuna esiste... il microscopio elettronico a trasmissione

m. ottico e m. elettronico a confronto

Microscopia elettronica Preparazione del tessuto Fissazione in glutaraldeide Postfissazione in tetrossido di osmio Disidratazione con alcol Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche Taglio all’ultramicrotomo Sezioni ultrafini di 20-40 nm Aumento del contrasto Coloranti elettronici come acetato di uranile o citrato di piombo

ultramicrotomo

l’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50-70 nm

Esempio di microscopia elettronica a trasmissione Le immagini di microscopia elettronica sono “in bianco e nero”. Le parti “scure” si dicono elettrondense. L’altissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari. linfocito

stereomicroscopio la luce incide sull’oggetto e viene riflessa da esso si osservano oggetti in rilievo

Microscopio elettronico a scansione poi c’è anche... Microscopio elettronico a scansione

Microscopio elettronico a scansione Risoluzione inferiore rispetto alla ME a trasmissione Consente di valutare il rilievo degli oggetti Usata per lo studio delle superfici cellulari

Questione di dimensioni… 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å Occhio umano l’osservazione di diversi livelli di organizzazione della materia vivente richiede l’uso di diversi strumenti cell. epiteliali globuli rossi batteri Microscopio ottico virus Microscopio elettronico a scansione proteine aminoacidi Microscopio elettronico a trasmissione atomi

alcuni esempi di microscopia elettronica a scansione… capello

formica

“bug”

ragno

tipi di microscopio Tipo di osservazione Sezioni di tessuto Morfologia esterna Fonte di energia Luce visibile Microscopio ottico Stereo-microscopio Elettroni Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione tipi di microscopio