Il sequenziamento genico

Struttura del DNA Doppia elica formata da due filamenti di ac. nucleico uniti da ponti ad idrogeno Ac. nucleico: catena di nucleotidi Nucleotide: nucleoside + ac. fosforico Nucleoside: desossiribosio + base azotata Basi azotate: adenina, citosina, guanina e timina

Le basi azotate Unico elemento variabile all’interno dell’ac. nucleico Sequenziamento: individuazione della successione delle basi azotate nel filamento di ac. nucleico

Le basi azotate Complementarità fra i due filamenti: 5’-3’: forward G-C 5’-3’: forward 3’-5’: reverse

Sintesi del DNA

Prima del sequenziamento Scelta del bersaglio Presente in tutti gli organismi Conservato ma contenente regioni variabili Disponibilità di un database contenente le sequenze con cui si vuol confrontare il bersaglio Scelta dei primer Estrazione del DNA dalle cellule

Le fasi del sequenziamento Amplificazione del bersaglio Verifica dell’amplificato Purificazione Verifica PCR di sequenziamento Purificazione dell’amplificato

Miscela di sequenziamento Primer Due amplificazioni parallele usando in ciascuna un solo primer (per i filamento forward o reverse) Tampone Polimerasi Nucleotidi Nucleotidi terminator

Nucleotidi terminator Nucleotide (A) che blocca l’allungamento del filamento di ac. nucleico poiché la mancanza del gruppo ossidrile in 3’ impedisce l’attacco all’ac. fosforico del nucleotide successivo

PCR di sequenziamento (metodo manuale) Si esegue in quattro provette diverse Tutte e quattro le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali e primer Ciascuna delle quattro provette contiene inoltre un diverso tipo di nucleotide terminator (adenina-terminator, guanina-terminator, . . .) Annealing del primer Allungamento del primer: Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca In ciascuna delle 4 provette contenente nucleotidi terminator con una diversa base azotata si formano soltanto filamenti che terminano con tale base. Tali filamenti avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione possibile

Il principio del sequenziamento (metodo manuale) Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione delle 4 provette in 4 corsie parallele così che in ognuna di esse siano presenti filamenti che terminano con una diversa base Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare frammenti di DNA che differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il gel (0,3-0,4 mm di spessore) è interposto fra due lastre di vetro di notevole lunghezza (40 cm circa ).

Il principio del sequenziamento (metodo manuale) La migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del filamento La posizione della banda indica la posizione occupata all’interno della sequenza, mentre il tipo di base è indicato dalla corsia in cui tale banda si trova A T A C A G C T G T T . . . . . .

Nucleotidi terminator marcati (metodo automatico) I nucleotidi terminator sono marcati con un fluorocromo Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di terminator

PCR di sequenziamento (metodo automatico) Si esegue in una singola provetta Tutte le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali, nucleotidi terminator e primer I nucleotidi terminator sono marcati con fluorocromi Annealing del primer Allungamento del primer: Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca Nella provetta si formano contemporaneamente filamenti che avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione della sequenza. Si avranno quindi contemporaneamente filamenti terminanti con ciascuna delle quattro basi

Il prodotto della PCR (sequenziamento automatico) Se il bersaglio è composto da n nucleotidi si avranno filamenti di tutte le lunghezze possibili, da 1 ad n Indipendentemente dalla lunghezza, tutti i filamenti terminanti con adenina emetteranno fluorescenza di tipo A ; quelli terminanti con citosina, di tipo B; quelli terminanti con guanina, di tipo C, e quelli terminanti con timina, di tipo D

Il sequenziatore automatico E’ un apparecchio che, dopo aver prelevato il prodotto della PCR di sequenziamento, lo sottopone ad elettroforesi all’interno di un capillare Un raggio laser colpisce il capillare eccitando la fluorescenza dei fluorocromi che lo attraversano Un cellula fotoelettrica rileva i segnali fluorescenti che vengono memorizzati

L’elettroferogramma Durante l’attraversamento del capillare i vari spezzoni di DNA vengono colpiti da un raggio laser Il raggio laser eccita i vari fluorocromi che marcano i singoli spezzoni Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa lunghezza d’onda Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle varie emissioni luminose ed il tutto viene registrato in forma grafica La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi; il tipo (colore del picco) corrisponde al tipo di base azotata mentre l’intensità (altezza del picco) è irrilevante

L’elettroferogramma Normalmente il sistema interpreta automaticamente l’elettroferogramma Quando l’interpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al posto della base azotata mancante, questa può essere corretta manualmente, dopo aver letto ad occhio l’elettroferogramma, o in base alla sequenza del filamento reverse G

Il sequenziamento in microbiologia Identificazione Sequenziamento di regioni specie-specifiche Antibiogramma Sequenziamento di regioni in cui possono aversi mutazioni associate alla resistenza ai farmaci Filogenesi Confronto della sequenza della medesima regione in specie diverse, per ricostruirne la storia evolutiva

Identificazione mediante sequenziamento Scelta della regione da sequenziare 16S rDNA Internal transcribed spacer 23S rDNA hsp65 rpoB Sequenziamento Confronto della sequenza con quelle presenti in un database

GenBank Banca dati pubblica (in Internet) contenente circa 50 milioni di sequenze geniche delle più varie regioni di, praticamente, tutti gli organismi viventi Chiunque può depositare (ovviamente non in maniera anonima) sequenze in GenBank E’ possibile confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame

GenBank BLAST

GenBank BLAST

GenBank, risultati

GenBank, risultati

GenBank, risultati

Interpretazione Identità 100% con una specie nota Identità 100% con una sequenza non appartenente a specie conosciute Identità <100% con una specie nota (il significato varia a seconda della regione in esame) Verifica delle discordanze Correzione della sequenza (identità 100%) Nuovo sequevar Nuova specie

Antibiogramma mediante sequenziamento Scelta della regione da sequenziare rpoB katG embB pncA Sequenziamento Confronto con la sequenza wild type

Interpretazione Confronto con la sequenza wild type Identità 100% = sensibilità Mutazioni = resistenza Conferma con l’antibiogramma fenotipico

Allineamento delle sequenze

Allineamento delle sequenze

Le mutazioni Principali mutazioni Mutazioni: errori della natura? Inserzione Delezione Sostituzione Conservativa Non conservativa Mutazioni: errori della natura? La selezione naturale premia le mutazioni favorevoli e elimina quelle sfavorevoli Regioni genetiche più o meno tolleranti

Mutazioni e filogenesi Evoluzione da un organismo ancestrale Sviluppo di nuovi organismi per effetto di mutazioni e selezione naturale Il numero, il tipo e la posizione delle mutazioni comparse, in regioni conservate, durante l’evoluzione costituiscono il metro con cui è possibile misurare le distanze filogenetiche Numero di mutazioni tanto più elevato quanto più remoto è il progenitore ancestrale Organismi con mutazioni concatenate appartengono allo stesso phylum

Regioni di studio Ideale: l’intero genoma Compromesso accettabile:16S rRNA Sequenziamento Multiallineamento Costruzione dell’albero filogenetico

L’albero filogenetico 4 mutazioni 5 mutazioni 5 mutazioni 7 mutazioni 4 mutazioni 2 mutazioni

L’albero filogenetico 4 mutazioni 5 mutazioni 5 mutazioni 7 mutazioni 4 mutazioni 2 mutazioni

L’albero filogenetico, limiti Non sempre, alberi basati su sequenze di regioni diverse, sono compatibili Non sempre alberi basati sulle stesse sequenze, ma costruiti con algoritmi diversi, sono sovrapponibili

Conclusioni L’uso del sequenziamento per l’identificazione e l’antibiogramma è particolarmente vantaggioso con: Organismi a crescita lenta Organismi difficilmente coltivabili Organismi non coltivabili Organismi morti (paleomicrobiologia) Per l’identificazione il sequenziamento è il metodo di riferimento; NON lo è per l’antibiogramma Il sequenziamento è una metodica: Rapida Automatizzata Economica