Colture a termine Colture continue La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte. Colture continue Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno annullato il programma genetico della senescenza

Colture cellulari aderenti in sospensione L’adesione è un fenomeno attivo che richiede l’interazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectina, adsorbite sulla piastra di coltura

Il sistema tampone utilizzato nei terreni è: Terreni per colture La soluzione di sali, glucosio, amminoacidi e vitamine costituisce il terreno base MEM Minimum Essential Medium DMEM Dulbecco’s Modification of MEM RPMI Roswell Park Memorial Institute Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in a.a. e sali e per la concentrazione di glucosio Il sistema tampone utilizzato nei terreni è: HCO3- / H2CO3

H2CO3 deriva dalla CO2 dell’atmosfera e in parte da quella prodotta dalle cellule Per questo motivo le cellule devono essere coltivate in atmosfera al 5% di CO2 e necessitano pertanto di incubatori con sistema di controllo dell’atmosfera! Altri sistemi tampone: HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonicacid) I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule vive i devono essere manipolate per tempi lunghi fuori dall’incubatore. In questo caso la CO2 dell’atmosfera non è sufficiente a mantenere il pH neutro per cui il terreno si alcalinizza con conseguente danno per le cellule

I terreni inoltre sono provvisti dell’indicatore rosso fenolo 7.3 6.8-7.0 > 7.6 pH Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa dell’acidificazione prodotta dalla CO2 proveniente dal metabolismo cellulare. Il colore viola india che le cellule non sono metabolicamente attive o che la regolazione della CO2 è errata

Il terreno al momento dell’uso viene completato con: Glutammina (è un amminoacido labile) Antibiotici Siero (in genere al 10%)

Colture di cellule aderenti Le cellule aderenti vengono poste in piastra e crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile Coltura confluente A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere trasferite in nuove piastre

Per staccare le cellule dal fondo si utilizza una soluzione di EDTA e tripsina EDTA = chela il Ca++ ed il Mg++ indispensabili per l’adesione Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti. Le cellule staccate devono essere riseminate e non crescono in modo efficiente e vanno incontro a morte se seminate al di sotto di una certa densità

arresto della crescita fase logaritmica di crescita Diagramma di crescita cellulare in vitro arresto della crescita a confluenza fase logaritmica di crescita

Test di vitalità cellulare Saggio con il Blu Tripano Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di determinazione della vitalità cellulare. Questo colorante permette di discriminare tra le cellule vitali e quelle morte in quanto è assunto solo dalle cellule morte

bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio mitocondrio MTT (giallo) Formazano MTT Colore (azzurro)

Piastre da coltura cellulare Le piastre per colture batteriche possono essere usate per colture cellulari in sospensione ma non per colture cellulari aderenti Le piastre per colture cellulari aderenti sono in polistirene ma sono trattate per renderle idrofile e cariche negativamente. In tal modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono l’adesione di diversi tipi di cellule

E’ importante la dimensione della piastra per la densità di semina Piastra da 5 cm di diametro Area di 20 cm2 Piastra da 9 cm di diametro Area di 60 cm2

Parametri critici per le colture cellulari Temperatura Le cellule possono sopportare l’ipotermia (sono conservate congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente disturbata. Non possono sopportare l’ipertermia (Anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule). Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per apoptosi

Due prove permettono di misurare l’influenza della temperatura sullo sviluppo delle cellule: - La valutazione dell’efficienza di un enzima mitocondriale.

- La valutazione della quantità di proteine sintetizzate dalla popolazione delle cellule.

Umidità relativa (RH %) In un incubatore a CO2 il paramentro di temperatura è direttamente collegato con l’umidità relativa (RH %) L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio per portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale. L’umidità relativa RH è un parametro che è portato ad un livello elevato senza necessariamente essere controllato. L’obiettivo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta nei terreni di coltura per non provocare un aumento della pressione osmotica.

La difficoltà maggiore consiste nel raggiungere un livello molto elevato di RH nella camera (RH >98%) evitando la condensazione sulle pareti o sugli oggetti contenuti nell’incubatore. Le goccioline di condensazione costituirebbero un ambiente ideale per la contaminazione e lo sviluppo di organismi dispersi nell’aria che entrano durante l’apertura dell’incubatore. Il pH E’ molto importante il sistema tampone che interviene verso la fine del periodo di coltura e cioè quando il metabolismo cellulare ha prodotto H+

E’ molto importante il sistema tampone che interviene verso la fine del periodo di coltura e cioè quando il metabolismo cellulare ha prodotto H+ CO2 La pressione parziale di CO2 usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg). In questo modo l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

Prevenzione della contaminazione Sono possibili differenti tipi di contaminazione - contaminazione da microorganismi dispersi nell’aria - contaminazione da biofilm - contaminazione proveniente dal campione - contaminazione incrociata