Basi della citofluorimetria a flusso Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camero di flusso Riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza La luce emessa viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer

Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila. Nel caso del campione riportato in figura, viene analizzata una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti granulocito linfocito monocito

(Forward Angle Light Scatter, FALS) Scatter Frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) granulocito Laser Sensore per il FALS linfocito monocito Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare.

Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantita’ di luce “scatterata” nella direzione frontale (lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Forward Scatter L’intensita’ del Forward Scatter e’ proporzionale alla dimensione, forma, ed omogeneita’ ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

(90 Degree Light Scatter) Scatter Laterale (90 Degree Light Scatter) granulocito Laser linfocito Sensore FALS monocito Sensore per il 90O LS Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter Laterale, a 90 gradi e che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser

Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita’ di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Side Scatter Anche l’intensita’ del side scatter e’ proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneita’ ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter Il Forward Scatter tende ad essere piu’ sensibile alle proprieta’ della superficie cellulare delle particelle e pertanto puo’ essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Il Side Scatter tende ad essere piu’ sensibile alle inclusioni presenti all’interno della cellula e pertanto puo’ essere usato per distinguere cellule granulate da quelle non-granulate.

Sistema ottico del citofluorimentro I filtri dicroici, i “bandpass” filtri permettono il passaggio della luce solo ad una certa lunghezza d’onda. cella di flusso filtri dicroici Fotomoltiplicatori (PTMT) filtri bandpass I fotomoltiplicatori, che raccolgono ed amplificano il segnale luminoso filtrato e ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1 funziona come scatter a 90 gradi, e raccoglie la luce rifratta/diffratta (“scatterata”) dalle cellule.

Filtri ottici: rilevamento dei parametri fisici Filtro dicroico/specchio a 45 gradi Sorgente luminosa Luce trasmessa Forward Scatter

Leucociti del sangue periferico Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico Leucociti del sangue periferico si possono facilmente identificare tre popolazioni: - linfociti, monociti granulociti. Si puo’ disegnare un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta 90 Degree Scatter Forward Scatter

Nuclei di linfociti normali o apoptotici 90 Degree scatter Forward scatter Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC.

Esempi di filtri ottici Standard Long Pass Filters 520 nm Long Pass Filter Sorgente luminosa Luce trasmessa I filtri ottici hanno il compito di pemettere il passaggio della luce emessa dai fluorocromi eventualmente legati alle cellule soltanto ad una certa lunghezza d’onda. Il filtro raccoglie la luce verde (tipicamente designata FL1),

Standard Short Pass Filters 575 nm Short pass Filter Sorgente luminosa Luce trasmessa < 575 nm Il filtro raccoglie la luce arancione (FL2).

Standard Band Pass Filters 630 nm Band Pass Filter Sorgente luminosa Luce trasmessa 620-640 nm Un terzo filtro può raccogliere la luce emessa ad una lunghezza d’onda ancora maggiore (in questo caso, nella regione del rosso profondo).

Raccolta della fluorescenza da una popolazione Laser Fluorescence detectors In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono stati identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su queste cellule è stata fatta l’analisi delle sottopopolazioni con anticorpi anti-CD3 (in FL1), anti-CD4 (in FL2) ed anti-CD8 (in FL3).

Cellule singole separate dentro diverse provette Il “Sorting cellulare” FALS sensor FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Fluorescence detector Piastre cariche elettricamente Cellule singole separate dentro diverse provette