LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSTICA DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli

La diagnostica tradizionale Esame microscopico test rapido ma scarsamente sensibile Esame colturale sensibile ma richiede da una a otto settimane problema delle contaminazioni Identificazione test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi analisi degli acidi micolici: buona specificità, eseguibili solo da coltura, messa a punto dei test complessa Antibiogramma diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni da ceppo isolato: tempi lunghi

Amplificazione genica, alternativa all’esame microscopico? Vantaggi sensibilità superiore (ma non di molto) specificità di specie (ed eventualmente anche di genere) Svantaggi esecuzione complessa costo elevato

Amplificazione genica, alternativa all’esame colturale? Vantaggi molto più rapida se positiva rende superflua l’identificazione eseguibile anche su campioni pesantemente contaminati Svantaggi non altrettanto sensibile non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie false negatività dovute agli inibitori false positività dovute a contaminazioni costo elevato esecuzione complessa impossibilità di eseguire l’antibiogramma

I target per l’amplificazione del M. tuberculosis complex Geni presenti in copia singola gene codificante per l’antigene da 65-kD (heath shock protein) Brisson-Noel et al. Lancet 1989 gene codificante per l’antigene da 126-kD (fusion protein) Hermans et al. J.C.M. 1990 gene codificante per lo rRNA 16S Boddinghaus et al. J.C.M. 1990 gene codificante per l’antigene di 38-kD (proteina b) Miyazaki et al. J.C.M. 1993 gene codificante per la subunità β della RNA polimerasi Kim et al. J.C.M. 1999 Sequenze ripetute IS6110 Eisenach et al. J.I.D. 1990

Amplificazione dei micobatteri, due approcci possibili in-house kit commerciali

Tecniche in-house PCR classica 2-tube nested PCR 1-tube nested PCR Reverse transcriptase PCR

Le tecniche utilizzate dai kit commerciali Polymerase chain reaction rDNA 16S rpoB Transcriptase mediated amplification rRNA 16S Strand displacement amplification IS6110 Real-time PCR

I kit commerciali Amplicor (Roche) Amplified M. tuberculosis direct test (Gen-Probe) BDProbeTec ET (Becton Dickinson) RealArt M. tuberculosis (Abbott)

Amplicor PCR del DNA (frammento contenente sequenze genere- e specie-specifiche del gene codificante per il rRNA 16S) Estrazione, manuale (in prospettiva automatica, col kit AmpliPrep) Amplificazione e rilevamento dell’amplificato automatizzata (Cobas) Rilevamento dell’amplificato con metodica colorimetrica (avidina-perossidasi) Prevenzione delle contaminazioni col metodo della Uracile-N-glicosilasi (AmpErase) Co-amplificazione, non competitiva, di un plasmide avente regioni di annealing identiche a quelle del bersaglio. La mancata amplificazione del plasmide indica la presenza di inibitori Riconoscimento degli amplificati mediante sonde M. tuberculosis complex- e plasmide-specifiche

Amplified M. tuberculosis direct test TMA di un frammento del rRNA 16S contenente sequenze genere- e specie-specifiche Amplificazione isotermica dovuta all’azione combinata di: transcriptasi inversa (sintesi di DNA dal RNA) RN-asi (separazione degli ibridi RNA-DNA) RNA-polimerasi (sintesi di RNA dal DNA) Riconoscimento dell’amplificato mediante sonde specie-specifiche Rilevamento dell’amplificato in chemio-luminescenza (HPA) Esecuzione interamente manuale ma semplice e rapida (non occorre il termociclatore ma occorre il luminometro)

RealArt PCR del DNA (frammento specie-specifico, di 163pb, del gene codificante per il rRNA 16S) Estrazione, manuale (usando kit del commercio) Amplificazione e rilevamento dell’amplificato automatizzata (ABI Prism sequence detection system) Rilevamento fluorimetrico dell’amplificato in tempo reale. Il segnale aumenta di intensità man mano che sonde specifiche, marcate con fluorocromo, ibridizzano con l’amplificato Co-amplificazione di un controllo interno da aggiungere al campione. La mancata amplificazione indica la presenza di inibitori Costruzione di una curva di taratura con 4 standard per la determinazione del numero di copie di DNA presenti nel campione

Strand displacement amplification (SDA) 1 Nella fase di produzione del target un primer ed un bamper, complementari di sequenze bersaglio molto vicine, si legano ad un filamento di DNA denaturato, il primer contiene un sito di restrizione in presenza di DNA-polimerasi primer e bamper si allungano e quest’ultimo spiazza il primer i filamenti spiazzati si uniscono ad altri primer e bamper dando luogo ad ulteriore allungamento-spiazzamento sito di restrizione bamper primer 5’ 3’ target

Strand displacement amplification (SDA) 2 Nella fase di amplificazione esponenziale nei dimeri, il filamento contenente il sito di restrizione viene tagliato in due frammenti da uno specifico enzima e la porzione a monte si allunga spiazzando quella a valle il frammento spiazzato funge da stampo per il primer a valle e contemporaneamente si allunga ricreando il sito di restrizione Un controllo interno, avente sequenza di annealing identica a quella del target, viene co-amplificato solo se non sono presenti inibitori La tecnica è isotermica

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

Amplificazione in house, pro e contro Costi minimi Sensibilità elevata Metodiche non standardizzate Contaminazioni non infrequenti Necessità di personale specializzato Brevetto Roche IDEALE PER LA RICERCA

Kit commerciali, pro e contro Kit tutto-incluso, con istruzioni Possibile fornitura delle apparecchiature in service Metodiche “robuste” Contaminazioni rare Omologazione solo per i materiali respiratori Costi medio-alti Sensibilità non eccelsa Rigidità delle metodiche IDEALE PER LA ROUTINE

Le raccomandazioni dei CDC 1 Il test di amplificazione non sostituisce esame microscopico e colturale Da eseguirsi solo su campioni selezionati L’attendibilità del test sui materiali non respiratori non è dimostrata sufficientemente Non utilizzabile per il monitoraggio della terapia

Le raccomandazioni dei CDC 2 microscopia negativa (3 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione positiva (2 campioni) amplificazioni discordanti (2 campioni) non TBC TBC ulteriori indagini

le raccomandazioni dei CDC 3 microscopia positiva (1, o più campioni) amplificazione positiva (1 campione) amplificazione negativa (2 campioni) monitoraggio degli inibitori presenti assenti TBC ripetizione del test micobatteriosi

Specificità delle reazioni di amplificazione Molto buona, attorno al 99% Cause di false positività contaminazione nella fase pre-analitica o analitica cross-ibridizzazione con micobatteri non-tubercolari ??? Principali fattori che influenzano positivamente la specificità automazione inattivazione degli ampliconi prodotti in precedenti amplificazioni (UNG)

Sensibilità delle reazioni di amplificazione Dati della letteratura estremamente variabili 90-100% nei campioni microscopico-positivi 40-80% nei campioni microscopico-negativi valori più bassi nei campioni extrapolmonari Principali cause di sovrastima della variabilità scelta di un gold standard improprio selezione dei campioni

Cause di false-negatività Presenza di inibitori Estrazione subottimale dell’ac. nucleico Distribuzione non omogenea dei bacilli all’interno del campione Campione non idoneo

Amplificazione genica, alternativa all’esame colturale? La coltura rimane ancora il test di riferimento per la diagnosi microbiologica della tubercolosi, i test genetici sono utili complementi ma sono lontani i tempi in cui potranno sostituirla I risultati dei test genetici devono essere sempre interpretati alla luce dei dati clinici e dei risultati della microbiologia tradizionale

DNA-probe, alternativa all’identificazione? Enorme risparmio di tempo Specificità pressoché assoluta Disponibili per un numero limitato di specie Costo Complessità di esecuzione

I DNA-probe commerciali AccuProbe (GenProbe) INNO LiPA Mycobacterium (Innogenetic) GenoType Mycobacteria (Hain)

AccuProbe Bersaglio: rRNA 16S Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente sulle colonie Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA) Specificità: M. tuberculosis complex MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente M. kansasii M. gordonae Limiti: test a cascata non disponibili per specie comuni in Europa ma rare negli USA

Solid-phase reverse hybridization

INNO LiPA Mycobacterium Bersaglio: regione spaziatrice fra i geni codificanti per lo RNA 16S e 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con 21 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii (differenziazione dei tipi I, II, III-IV-V-M. gastri) M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare (2 tipi) MAC M. scrofulaceum M. fortuitum M. marinum-M. ulcerans M. genavense M. haemophilum M. chelonae (differenziazione dei tipi I, III, II-IV) M. smegmatis M. malmoense M. celatum M. simiae Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) alcune reattività crociate con specie rare

GenoType Mycobacteria Bersaglio: gene codificante per lo rRNA 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con varie sonde immobilizzate su due strisce di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità Gram + ad alto contenuto di GC Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare M. scrofulaceum-M. paraffinicum M. malmoense-M. haemophilum-M. palustre-M. nebraskense M. peregrinum-M. septicum-M. alvei M. chelonae-M. immunogenum M. fortuitum 1 M. fortuitum 2-M. mageritense M. abscessus-M. immunogenum M. interjectum M. marinum-M. ulcerans Gram + ad alto contenuto di GC Mycobacterium genere M. simiae M. mucogenicum M. celatum I, III M. phlei M. szulgai-M. intermedium M. goodii M. haemophilum-M. nebraskense M. ulcerans M. gastri M. lentiflavum M. heckeshornense M. shimoidei M. genavense M. smegmatis M. kansasii M. asiaticum Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) numerose identificazioni non univoche incorretta identificazione dei MAC non-M. avium, non-M. intracellulare alcune reattività crociate con specie rare

GenoType Mycobacteria MTBC Bersagli: gene codificante per lo rRNA 23S gene girB regione RD1 Reazione: ibridizzazione inversa, con 9 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: M. tuberculosis complex M. tuberculosis M. africanum tipo I M. microti M. bovis M. bovis BCG M. caprae Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) mancato riconoscimento di M. africanum tipo II, di M. canettii e di M. pinnipedii

DNA-probe, alternativa all’identificazione? Le tecnologie basate sull’impiego di sonde sono attualmente in grado di sostituire i test fenotipici per l’identificazione dei micobatteri più comuni Per le specie più rare il test di riferimento è rappresentato dal sequenziamento

Il sequenziamento genico E’ la tecnica di riferimento per l’identificazione Possibili bersagli 16S rRNA o rDNA 23S rDNA spacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23S gene codificante per le heat shock proteins gene codificante per la superossido dismutasi

Tecnologia microarray-microchip Microarray: sistema multi-sonda miniaturizzato (controllato, o meno, elettronicamente) Identificazione in vari passaggi di numerosi ceppi (amplicon down) Identificazione di un solo ceppo con un solo passaggio (capture down)

Amplicon down I prodotti di PCR di vari micobatteri da identificare sono legati a differenti elettrodi di un micro-array Una o più sonde (marcate diversamente) sono aggiunte in sequenza A ciascun passaggio, il monitoraggio degli elettrodi che presentano ibridizzazione permette, in base alla specificità della sonda usata, l’identificazione del corrispondente amplicone

Capture down Varie sonde con diversa specificità sono legate ai singoli elettrodi di un micro-array Aggiunta del prodotto di PCR di un ceppo da identificare Rivelazione dell’amplificazione con l’aggiunta di un reporter (sonda marcata) che riconosca un tratto non specie-specifico della regione amplificata A che servono due sonde? La sonda di cattura non è sufficiente per il riconoscimento? Identificazione in base alla specificità della sonda legata all’elettrodo su cui si è avuta l’ibridizzazione

Epidemiologia molecolare Ricerca di marcatori, all’interno del genoma del microorganismo, dotati di specificità di ceppo Permette di ricostruire i flussi epidemici Permette di raggruppare i ceppi in grandi “famiglie” che riflettono il cammino dell’evoluzione Permette il riconoscimento delle infezioni miste Permette di differenziare le recidive dalle reinfezioni Individua le contaminazioni di laboratorio

IS6110

IS6110 Lunghezza 1361 pb; numero di copie 5-20; posizione variabile

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Fingerprinting in base al IS6110

Alcuni pattern RFLP

RFLP: Toscana, anni 2002 Ceppi raccolti: 245 Pattern RFLP: 215 Cluster di 2 ceppi: 19 di 3 ceppi: 3 di 4 ceppi: 1 Nessun focolaio epidemico Tre contaminazioni di laboratorio

Il locus DR (direct repeat)

Il locus DR Da 9 a 50 sequenze ripetute di 36 bp (DR) inframmezzate da sequenze non ripetute di 35-41 bp (spaziatori) 1 5 10 15 20 25 30 35 40 1 2 4 5 6 DR BCG DR 1 2 4 5 6 H37Rv 3 spaziatore DR

Spoligotyping BCG H37Rv X 5 10 15 20 25 30 35 40

I ceppi Beijing 5 10 15 20 25 30 35 40 H37Rv Beijing I vari spolygotipi possono essere raggruppati (in base alle somiglianze) in famiglie I ceppi della famiglia Beijing hanno soltanto gli spaziatori 35-43 Presenti originariamente in Cina, vengono oggi isolati, con frequenza crescente, in quasi tutti i paesi del mondo Fra le caratteristiche principali: spiccata virulenza frequente sviluppo di resistenze multiple

I ceppi Beijing isolati nel 2002 804 836 763 952 669 884 974 1 5 10 15 20 25 30 35 40

I ceppi Beijing toscani 2002: 7 ceppi, pari al 3% 2003: 16 ceppi, pari al 6%

Altre famiglie I ceppi isolati in Toscana includono rappresentanti di molte delle famiglie a larga diffusione mondiale Non mancano ceppi (specialmente fra gli extra-comunitari) appartenenti a famiglie a diffusione più limitata E’ stata denominata “Tuscany” una famiglia mai segnalata in precedenza, rappresentata da 8 ceppi isolati da pazienti italiani

RFLP e spoligotyping RFLP: interessa l’intero cromosoma alto potere discriminante impossibile l’impiego dell’amplificazione Spoligotyping: interessa una porzione limitata de genoma ceppi diversi possono avere identico spoligotipo possibilità di ricorso all’amplificazione Possibile compromesso: esecuzione dello spoligotyping su tutti i ceppi e approfondimento mediante RFLP su quelli risultati identici o “interessanti”