ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

ENZIMI Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo Sono caratterizzati da: elevato potere catalitico altissima specificità E + S ES E + P

ENZIMI G X Y Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per: DG Y Reazione non catalizzata DG* DG* Reazione catalizzata Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per: Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate. Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti. L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.

ione metallico coenzima gruppo prostetico OLOENZIMA COFATTORI ENZIMATICI Oloproteine l’attività dipende soltanto dalla struttura proteica Eteroproteine: l’attività richiede uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori Il cofattore può essere: un coenzima (NAD+, NADP+, ADP, ATP) un gruppo prostetico (FMN, FAD) uno ione metallico (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+) ione metallico coenzima gruppo prostetico (legato covalentemente) OLOENZIMA APOENZIMA (Parte proteica)

VITAMINE: precursori di coenzimi COFATTORI VITAMINE: precursori di coenzimi

CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI Gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali a seconda della natura generale delle reazioni catalizzate: ossidoreduttasi transferasi idrolasi liasi isomerasi ligasi Ciascuna classe comprende delle sottoclassi, che a loro volta comprendono delle sotto-sottoclassi Un enzima ha generalmente: un nome comune un nome sistematico un numero di classificazione

NOMENCLATURA

UNITÀ DI MISURA Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica (o attività enzimatica) L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.) Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato al minuto in condizioni standardizzate

  G6125   Glucose  Oxidase Aspergillus niger   Type II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen) Synonyms b-D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase GOx G.Od. CAS Number 9001-37-0 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.3.4 EG/EC Number EINECS MDL number MFCD00131182 Analysis Note Protein determined by Biuret method. Caution Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice. Linkage This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate. Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole of b-D-glucose to D-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%. Properties storage temp. -20°C foreign activity Catalase£2 Sigma units/mg solid amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 % References Merck Merck13, 4473 Safety Information Hazard Codes Xn Risk Statements 42 Safety Statements 22-45 RTECS RQ8452000

P6782   Peroxidase horseradish   Type VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) 250-330 units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder   Synonyms Horseradish peroxidase Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase CAS Number 9003-99-0 Enzyme Commission (EC) Number 1.11.1.7 EG/EC Number 2326686 MDL number MFCD00071339 Analysis Note This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid Linkage Similar to P8375 Packaging Packaged in mg solid Unit Definition One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0 Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed. The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at 0.5-1.0 mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity. One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C. Description

C5421   Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp.   buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret)   Synonyms Cholesterol: oxygen oxidoreductase CAS Number 9028-76-6 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.3.6 MDL number MFCD00130783 Unit Definition One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization. Physical form Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 storage temp. -20°C Literature Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977) Identifiers Description Properties References

  Glucose  Dehydrogenase Bacillus megaterium   BioChemika ~33 units/mg 49165 Identifiers Synonyms b-D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase CAS Number 9028-53-9 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.1.47 EG/EC Number 2328369 MDL number MFCD00131181 Description Miscellaneous NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmolb-D-glucose to D-glucono-d-lactone per minute at pH 7.6 and 25°C Properties mol wt Mr~120000 storage temp. -20°C References Literature A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990)

ISOENZIMI Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica, diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale, affinità per substrato e coenzima….. Es. Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)

METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI METODI NON SELETTIVI Metodi elettroforetici Metodi cromatografici Metodi di elettrofocalizzazione

METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI METODI SELETTIVI Inibizione chimica Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,… Inibizione fisica Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e lattato deidrogenasi Inibizione immunologica Anticorpi Reattività selettiva verso un substrato Determinazione di LDH1

Infarto miocardico

Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta ESEMPIO DI UTILIZZO DIAGNOSTICO DI ISOENZIMI Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta

ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE E + S ES E + P L’energia libera di attivazione DG è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche stato iniziale stato finale stato di transizione energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata) energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata) cambiamento totale di energia libera durante la reazione direzione della reazione energia libera

ATTIVITÀ ENZIMATICA L’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione. Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

CINETICA CHIMICA Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione che indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti Reazioni di ordine 0 La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti Reazioni di 1° ordine A P Reazioni di 2° ordine A + B P 2 A P

vmax CINETICA ENZIMATICA A P E A P In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta E A P In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso Il grafico velocità-concentrazione è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, mentre V e Km sono due costanti [substrato] velocità vmax

EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES] Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui Vmax = k2[E] L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima k1 k2 E + S ES E + P k-1

CINETICA ENZIMATICA ] [ s K > ] [ K s E k v × = V Regione 1 Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni Regione 1 1 2 3 ] [ s K m > 1° ordine ] [ 2 K s E k v m × = max V La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

CINETICA ENZIMATICA ] [ s v V  2 ] [ s K > ] [ E k v = V Regione 2 intermedie ordine misto v max V  2 1 2 3 Regione non utile dal punto di vista analitico Regione 3 ] [ s K m > ordine 0 ] [ 2 E k v = max V Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica

v  > CINETICA ENZIMATICA 3 2 1 2 3 Velocità della reazione Regione 2 Regione non utile dal punto di vista analitico intermedie ordine misto v  Regione 3 Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica ordine 0 > Velocità della reazione [s]

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE [P] 1 2 tempo La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione (v0) o (vi) Vantaggi: Si misura sicuramente la Vmax L’enzima è in buone condizioni Non ci sono problemi di inibizione da prodotto Possibilità di distinguere tra attività enzimatiche diverse Metodi analitici rapidi

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Segnale analitico s t tempo (s/T) Approccio dispendioso in termini di tempo Si utilizzano metodi ad un punto, a due punti, multipunto

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau tempo [P] Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo Inconvenienti: difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE METODI AD UN PUNTO Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione Affinchè la misura sia accurata: il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura segnale Sx tx tempo La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione. In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE METODI AD UN PUNTO Approccio tecnico Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore) Metodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione. Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE METODI A DUE PUNTI Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema Affinchè la misura sia accurata: ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t1 e t2 ai quali viene eseguita la misura segnale S2 Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come DS / Dt S1 t1 t2 tempo

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE METODI A DUE PUNTI Approccio tecnico Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti Metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale Metodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure

ENZIMI IN DIAGNOSTICA Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma Aumento del turnover cellulare Proliferazione cellulare (neoplasia) Aumento di sintesi enzimatica (induzione) Lesione di un tessuto Ostruzione della secrezione Diminuzione della eliminazione (clearance) Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da: sintesi dell’enzima stato d’integrità delle membrane cellulari fenomeni di distribuzione velocità di eliminazione

Alcuni enzimi del plasma Enzima Organo Cause di aumento Note Fosfatasi alcalina (ALP) Fegato, osso, placenta, epitelio intestinale Gravidanza, infanzia Osteomalacia, cirrosi epatica, Tumori ossei, iperparatiroidismo, fratture, infiammazione intestinale Isoenzimi identificabili per elettroforesi Fosfatasi acida Prostata Tumore prostatico Enzima labile Aspartato transami-nasi (AST o GOT) Fegato e miocardio Epatite/necrosi epatica, Infarto, traumi, malattie muscolari, epatite cronica Fisiologico in neonati Normale: ALT<AST Epatite: ALT>AST Gamma glutamil transferasi (GGT) Fegato, rene, pancreas Colestasi epatica Epatite, cirrosi, pancreatite Ingestione di alcool o farmaci, insufficienza cardiaca Marker di sindromi epatobiliari Creatin chinasi (CK) Distrofia muscolare, infarto del miocardio BB cervello MB cuore MM muscolo Amilasi Ghiandole salivari, pancreas Pancreatite, ulcera duodenale, ostruzione intestinale, chetoacidosi diabetica, calcoli o infiammazione delle ghiandole salivari Lattato Deidrogenasi (LDH) Isoenzimi danno indicazioni più specifiche Alanina Transaminasi (ALT o GPT) Fegato Aumenta in epatiti e cirrosi Colineste-rasi Livello basso indica disfunzione epatica

Il profilo a campana è il più comune EFFETTO DEL pH 6 8 10 tripsina colinesterasi 4 papaina 2 pepsina pH attività enzimatica relativa Il profilo a campana è il più comune

EFFETTO DELLA TEMPERATURA T (°C) attività enzimatica relativa 20 40 60 Gli enzimi hanno diversa stabilità termica La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica

MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Reazioni enzimatiche semplici S E P Condizioni sperimentali Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso pH e Temperatura controllati rigorosamente Attenzione alla inibizione da substrato

MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Reazioni enzimatiche accoppiate S Eprim. P1 Eind. P2 k1 k2 S Eprim. P1 Eind. P3 Eaus. P2 Condizioni sperimentali Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso pH e Temperatura controllati rigorosamente Altre condizioni peculiari La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria può seguire una via metabolica diversa Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k2 / k1 ≥ 100

DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse con i seguenti vantaggi: L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapidità Maggiore accuratezza Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

CINETICA ENZIMATICA ] [ s K > ] [ K s E k v × = V Regione 1 Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni Regione 1 1 2 3 ] [ s K m > 1° ordine ] [ 2 K s E k v m × = max V La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI S Eind. P Le condizioni sperimentali (enzima indicatore in eccesso, pH e T ottimali) non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente Esempio: acido lattico Acido lattico + NAD+ Acido piruvico + NADH + H+ LDH Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione (idrazina)

METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI S Eaus. P1 Eind. P2 Condizioni sperimentali Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso pH e Temperatura ottimali La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato

METODI DI MISURA La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse Tali proprietà devono poter essere misurabili I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: spettrofotometrici luminometrici Altri metodi sono: potenziometrici, conduttometrici, polarografici Ci sono, inoltre, metodi basati su enzimi immobilizzati

METODI SPETTROFOTOMETRICI I metodi spettrofotometrici sono quelli maggiormente utilizzati e si basano su: Misura diretta Misura mediante derivati chimici Misura mediante derivati generati enzimaticamente

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura diretta Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici) Esempio: p-nitrofenilfosfato +H2O p-nitrofenolo + fosfato fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo) Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami) Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV: lampada a idrogeno per generare l 200-300 nm cuvette di quarzo costose proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV AP

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura diretta L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P)+ Lunghezza d’onda (nm) Assorbanza Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura mediante derivati chimici Sali di tetrazolio Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare e N R3C NR2 N+R1 Cl- CR3 R2N + N N+ Rx Ry 2Cl- Sale monotetrazolico Sale ditetrazolico R = gruppi aromatici

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura mediante derivati chimici Sali di tetrazolio Esempio: alcol deidrogenasi Alcol deidrogenasi Etanolo Acetaldeide NAD+ NADH + H+ PMS PMSH Prodotto di riduzione (formazano) Sale di tetrazolio PMS = fenazina metasolfato Il valore di e dei formazani (e=20 m2/mol) è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H (e=6.3 m2/mol) , perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = ebc)

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con ossidoreduttasi X + NAD(P)H + H+ XH2 + NAD(P)+ YH2 + NAD(P)+ Y + NAD(P)H + H+ Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH) 2-Oxoglutarato Glutammato Alanina Piruvato Lattato NADH + H+ NAD+ ALT LDH

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con perossidasi Esempio: glucosio ossidasi Glucosio Acido gluconico H2O + O2 H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico Prodotto colorato o fotoni Glucosio ossidasi Perossidasi

METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con perossidasi Esempio: fosfolipasi Fosfatidilcolina + 2H2O Acido fosfatidico + Colina Fosfolipasi Colina + 2O2 Betaina + 2H2O2 Colina ossidasi 2H2O2 + Accettore Prodotto colorato + 2H2O + O2 Perossidasi

ASPETTI QUANTITATIVI Nel caso della concentrazione dell’analita nel campione tramite enzimi, nei metodi spettrofotometrici questa viene determinata mediante: interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione costruita con degli standard a concentrazione nota di analita confronto con un’unico standard, attraverso la relazione derivante dalla legge di Lambert-Beer Quando non si dispone di uno standard puro, la concentrazione dell’analita viene ricavata mediante il coefficiente di estinzione molare e del prodotto colorato, sfruttando la legge di Lambert-Beer

ASPETTI QUANTITATIVI Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione e del volume v del campione: Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da applicare funzioni che tengono conto di questi fattori

METODI NON SPETTROFOTOMETRICI Misure conduttimetriche CO(NH2)2 + H2O 2NH4+ + CO32- Ureasi Esempio Utilizzo di elettrodo specifico per NH4+ Misure polarografiche glucosio + O2 acido gluconico + H2O2 Glucosio ossidasi Esempio perossidasi Utilizzo di elettrodo selettivo per O2 derivatizzazione chimica accettore prodotto colorato È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio

METODI NON SPETTROFOTOMETRICI Misure potenziometriche Esempio triacilgliceroli + H2O diacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi- + H+ Lipasi Utilizzo di elettrodo per H+ (misura di pH) Misure microcalorimetriche Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche

ENZIMI IMMOBILIZZATI Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici Vantaggi Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi) Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili) Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari

ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico CO(NH2)2 + 2H2O + H+ 2NH4+ + HCO3- Ureasi Esempio Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi L’urea permea il gel dove viene idrolizzata dall’enzima formando ioni ammonio In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente all’idrolisi enzimatica dell’urea

PRINCIPI DI RIVELAZIONE Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali: spettrofotometria spettrofluorimetria un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi): chemiluminescenza

BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia Prodotto + [Accettore]* Substrato CL [Prodotto]* Prodotto + hn Accettore + hn + Accettore Diretta Indiretta

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Luminolo/H2O2/Perossidasi luminolo NH NH2 O aminoftalato + N2 + H2O + hn perossidasi H2O2/OH- COO-

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI 1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina HPO42- O + - C H 3 * F h n OPO32- A M P D fosfatasi alcalina

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI 1,2-Diossietani-fenil-b-D-galattopiranoside/b-Galattosidasi O C H 3 o - h n + b -galattosidasi *

SISTEMI BIOLUMINESCENTI Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis (lucciola nord-americana) L’efficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1 luciferina + ATP + O2 ossiluciferina + CO2 + AMP + P~P + luce luciferasi Mg2+ + A M P luce N S H O C T 2 , g luciferina pirofosfato FBL/CL = n. fotoni emessi n. molecole reagenti

SISTEMI BIOLUMINESCENTI Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una ossidoreduttasi che produce FMNH2 NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2 FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + luce ossidoreduttasi luciferasi C H 3 ( 2 ) 1 O + F M N luciferina batterica luciferasi batterica luce O 2

ASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHE La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi In presenza di un eccesso di substrato l’intensità del segnale luminoso è proporzionale all’attività enzimatica Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima l’intensità dell’emissione luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione adatto all’analisi quantitativa Caratteristiche analitiche: Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a quella dei radioisotopi Minimo segnale di fondo dovuto alla matrice biologica rispetto alla fluorescenza Ampio intervallo dinamico Rapidità di risposta Costi ridotti e minori rischi rispetto all’uso di marcatori radioattivi

APPLICAZIONI ANALITICHE Luminolo/H2O2/Perossidasi Determinazione dell’attività della perossidasi endogena in fluidi biologici, omogenati di tessuto, .. Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H2O2/H2O colesterolo ossidasi colesterolo H2O2 fosfolipasi D colina ossidasi fosfolipidi colina H2O2 perossidasi luminolo aminoftalato + N2 + H2O + hn H2O2/OH-

APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi da lucciola Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi adeninici in campioni biologici Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono chinasi e la formazione o degradazione di ATP creatinina creatina creatina + ATP creatina-fosfato + ADP ATP + luciferina + O2 AMP + P~P + CO2 + ossiluciferina + hn creatinina ammide idrolasi creatina chinasi luciferasi Mg++

APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi batterica Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con maggiore sensibilità per il NADH (fmoli) Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H R-OH + NAD+ R=O + NADH NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2 FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + hn 7a-idrossisteroide-deidrogenasi ossidoreduttasi luciferasi

APPLICAZIONI COMMERCIALI Rapid Enzymatic Tests for Glucose   Introduction: Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below. Step 1: Glucose -----------Glucose Oxidase --------Glucose ----------------------- > Gluconic Acid + H2O2 Step 2: Clinistix and Dextrostix: ----------H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase --------H2O2 + chromogen orthotolidine ------------- > oxidized orhotolidine --------Diastix: --------H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase --------H2O2 + Potassium iodide ------------------ > iodine complex     The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples. Materials: Please refer to class notes and p. 82-82b of the Laboratory Manual  .   Bottles of Reagent Strips Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used Procedure: Clinistix:  · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided Dextrostix:  · Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately Diastix:  · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

CINETICA ENZIMATICA A P In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta E A P In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso Il grafico velocità-concentrazione è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, mentre V e Km sono due costanti [substrato] velocità

VELOCITÀ MASSIMA (Vmax) La costante V rappresenta la velocità massima (Vmax) o limitante della reazione e si raggiunge ad alte concentrazioni di substrato All’aumentare di [s], la velocità aumenta e tende asintoticamente al valore massimo, che non può essere superato indipendentemente dall’aumento di [s], perché ad alte concentrazioni di s l’enzima è saturato In queste condizioni la velocità di reazione non dipende da [s] ed è quindi di ordine 0 k1 k2 E + S ES E + P k-1 [substrato] velocità Vmax ½ Vmax Km Ad elevata [s] lo stadio limitante della reazione è la conversione del complesso attivato ES a prodotto P + E Vmax rappresenta la velocità a [s] infinita, quindi è la velocità dello stadio limitante Di conseguenza, Vmax rappresenta una misura diretta dell’abilità dell’enzima di convertire il substrato in prodotto, cioè della attività enzimatica

COSTANTE DI MICHAELIS (Km) La costante di Michaelis (Km) è definita come la concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è uguale alla metà della velocità massima (1/2 Vmax) Substrato, enzima e complesso enzima-substrato si trovano in uno stato di equilibrio. Ad alte concentrazioni di substrato l’equilibrio è tutto spostato verso destra, quindi l’enzima è saturato e la velocità raggiunge il valore massimo. Nel punto in cui metà delle molecole di enzima sono saturate la velocità sarà metà della Vmax k1 k2 E + S ES E + P k-1 La posizione dell’equilibrio dipende anche dalla forza dei legami tra substrato ed enzima. Più essi sono deboli, più alta è la concentrazione di substrato necessaria per avere il 50% di saturazione dell’enzima, quindi più alto sarà il valore di Km Km è una espressione della affinità dell’enzima per il substrato: basso valore di Km alta affinità alto valore di Km bassa affinità [substrato] velocità Vmax ½ Vmax Km

EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN ] [ s K m > ] [ 2 E k v = max V In condizioni di eccesso di substrato la velocità delle reazioni enzimatiche dipende solo dalla concentrazione di enzima La Vmax sarà proporzionale alla concentrazione di E, quindi sarà una misura di attività enzimatica

Velocità della reazione CINETICA ENZIMATICA k1 k2 E + S ES E + P k-1 Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni: Regione 1 1 2 3 Velocità della reazione > 1° ordine v=k2[ES] La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

APPROCCIO ALTERNATIVO ALLA MISURA DI VELOCITÀ INIZIALE Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau tempo [P] Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo Inconvenienti: difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse