Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti In-line Tissue Engineering approach Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti Biella 5 giugno 2009

La perdita o l’insufficienza funzionale di un tessuto o di un organo rappresentano uno dei problemi più invalidanti, frequenti e costosi nell’ambito della sanità. Il problema non è esclusivamente limitato alla mancanza di organi in toto - fegato, rene, cuore, pancreas - ma coinvolge anche deficit tissutali localizzati e limitati a parti di non vitale importanza che comunque determinano una scarsa qualità della vita.

Mentre la perdita di un organo viene necessariamente compensata con un trapianto, nel caso di perdite di sostanza il chirurgo deve ingegnarsi su come ricostruire, utilizzando i tessuti residui o con ciò che viene messo a disposizione dalle industrie dei biomateriali, la struttura e la funzione dei tessuti danneggiati.

PASSATO Biomateriali improvvisati e tentativi di riparazione sono antichi come il desiderio e la necessità dell’uomo di sostituire parti del corpo difettose per migliorare la qualità della vita.

NASCE LA MEDICINA Papiro di Edwin Smith (1850) 48 casi clinici: 27 traumi cranici; 6 lesioni della gola e del capo; 2 della clavicola; 3 delle braccia; 8 dello sterno; 1 della spalla; 1 della colonna vertebrale. 1700 a.C. The Edwin Smith Surgical Papyrus Lungo 4.68 metri e largo 33 cm, fu scritto sulla base di testi più antichi di circa 1000 anni 2600 a.C. Sacerdote, ufficiale, costruttore e architetto visse alla corte del faraone Djoser (III Dinastia). Quasi universalmente riconosciuto come il “Padre della Medicina” Alluce in cuoio e legno Sacerdotessa di Tebe (1.000 a.C.) (Museo del Cairo) Chiodo di 23 cm in ferro inserito nel ginocchio. Mummia di Usermontu (656-525 a. C.) (Museo di San Josè, CA)

LE PRIME PROTESI Canino legato con filo dìoro a due incisivi (Cairo) Incisivo artificiale (tomba etrusca) Protesi dentaria dei Fenici costituita da conchiglie legate con filo d’oro (V-VI sec. a.C.) Mandibola trovata in Honduras nel 1931, presenta tre frammenti di conchiglia in luogo degli incisivi inferiori. Databile intorno al 600 d.C.

MIRACOLI “El milagro de Calanda” Atti notarili e processuali testimoniano lo strano reimpianto di gamba di Miguel Juan Pellicer nel 1640 a Calanda (Bassa Aragona, Spagna) I santi Cosma e Damiano attorno al 300 avrebbero attaccato la gamba di un moro ad un cristiano.

IL PRIMO INNESTO ETEROLOGO Nel 1668 il medico olandese Job Van Meekeren esegue il primo innesto osseo eterologo innestando un frammento di cranio di cane in un difetto craniale di un soldato rimasto ferito. Il soldato venne scomunicato. Per questo chiese di farsi togliere l’innesto, ma non fu possibile perché risultò completamente integrato. (De Boer 1988)

LA STRUTTURA DELL’OSSO Antoni Van LeeuwenhoeK nel 1674 descrive per la prima volta la struttura ossea relativamente a quelli che saranno poi chiamati canali Haversiani. Si cominciano ad evidenziare concetti come “callo osseo”, “impianto” e “riassorbimento”. Nel 1743 Duhamel pubblica i risultati dei suoi esperimenti su animale dove suggerisce il ruolo importante del periostio nella neo-osteogenesi. (De Boer 1988, Glicenstein 2000)

INNESTO AUTOLOGO E OMOLOGO Leopold Ollier studia il fenomeno della rigenerazione ossea e pubblica nel 1861 il “traité de la régénération des os” documento in cui compare per la prima volta il termine “greffe osseuse”: innesto osseo Il primo innesto autologo Germania 1820: Philips Von Walter chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata. Il chirurgo scozzese William Mac Ewen nel 1880 innesta un segmento di tibia da donatore in un difetto omerale di un ragazzo.

PRESENTE E FUTURO… PROSSIMO Riparazione o sostituzione di organi e di tessuti rimossi “Riparare” “Rigenerare” Ripristino di strutture Attività biochimica Proprietà biomeccaniche Funzione

L’ingegneria dei tessuti è un “campo multidisciplinare” TISSUE ENGINEERING L’ingegneria dei tessuti è un “campo multidisciplinare” in cui si fondono biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali e chirurgia, allo scopo di costruire nuovi tessuti funzionali, mediante la combinazione di: Scaffold Cellule autologhe Fattori di crescita Ingegneria Tissutale Applicazione clinica

SEMPLICEMENTE “…the science of persuading the body to regenerate or repair tissues that fail to regenerate or heal spontaneously” C. M. Agrawal host tissue scaffold Solo scaffold Scaffold + fattori di crescita Scaffold + cellule + fattori di crescita Scaffold + cellule Biomaterials Research Group 2004

cataboliti intrappolati BASTA IL SOLO SCAFFOLD? Scaffold impiantato osso Coagulo ematico Adesione di proteine, GFs,… Invasione di vasi sanguigni Cellule aderiscono, proliferano e differenziano Richiamo e penetrazione cellulare Pori riempiti di ECM Nutrienti bloccati, cataboliti intrappolati Cellule sintetizzano e depositano matrice extracellulare (ECM) Cellule al centro MUOIONO Fallimento dello scaffold ?

SOLO Tissue Engineering piccoli difetti < 2-3mm alternativa Scaffold Cellule Fattori di crescita Tissue Engineering Tessuto osseo danneggiato

In-line TISSUE ENGINEERING Utilizzare i requisiti e i principi dell’ingegneria tissutale, direttamente in sala operatoria

Necessità di un BIOMATERIALE 1. LO SCAFFOLD Necessità di un BIOMATERIALE Fornisce un’impalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee cellulari e la deposizione di matrice extracellulare Svolge un’importante funzione di interazione biologica: comunicazione e scambio di segnali con il tessuto circostante Controllo della struttura e della funzione del tessuto ingegnerizzato

BIOMATERIALE IDEALE biocompatibile favorire - adesione - migrazione - proliferazione - differenziamento cellulare - sintesi di matrice extracellulare (ECM) - invasione vascolare biodegradabile

INTERAZIONE CELLULA-BIOMATERIALE La capacità di una cellula di riconoscere ed interagire con il substrato rappresenta il primo indispensabile passo, senza il quale processi come proliferazione, migrazione e differenziamento cellulare non sarebbero possibili. Nella progettazione di materiali per l’ingegneria dei tessuti, la comprensione dei meccanismi che regolano tale interazione sono di fondamentale importanza.

RICONOSCIMENTO E ADESIONE Uno dei requisiti fondamentali di un biomateriale per l’ingegneria dei tessuti è la capacità di promuovere efficientemente l’adesione delle cellule da cui verrà colonizzato. Tale adesione prevede una fase precoce in cui la cellula riconosce il substrato. L’adesione cellulare ad un biomateriale avviene tramite un meccanismo specifico, mediato da proteine di membrana dette integrine.

Le integrine trasmettono il segnale dalla superficie cellulare alla fitta rete di filamenti citoscheletrici che costituiscono l’impalcatura della cellula. Dall’interazione delle integrine con la matrice si originano cascate di segnali che determinano la riorganizzazione del citoscheletro di actina ed il cambiamento della morfologia cellulare. La cellula, all’inizio tondeggiante (a), assume una forma distesa (b).

QUALE SCAFFOLD SCEGLIERE Sicurezza Aspetti medico-legali Innesto omologo Biocompatibilità Immunogenicità Qualità Innesto eterologo Porosità Degradabilità Innesto di sintesi

PURA MATRICE BIOLOGICA Gli innesti eterologhi prodotti da Bioteck con un sistema esclusivo di deantigenazione enzimatica a 37° C sono sicuri, totalmente biocompatibili e con la componente collagenica preservata

INNESTI FLEX Un sistema di demineralizzazione parziale, consente inoltre di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche. La demineralizzazione espone maggiormente la matrice collagene esaltandone così le caratteristiche biologiche.

Fattori di crescita (growth factors, GFs): 2. I FATTORI DI CRESCITA Fattori di crescita (growth factors, GFs): sono polipeptidi che agiscono legandosi generalmente a recettori ad attività tirosina-chinasica, inducendo una gamma complessa di risposte che influenzano il destino della cellula bersaglio. Possono avere un ruolo mitogenico (ad es. bFGF sui condrociti) oppure trofico-differenziativo (ad es. BMP-1 sulle cellule mesenchimali e pre-osteoblasti).

COSA OFFRE IL MERCATO Autologhi Piastrinici PDGF; TGF-ß1, ß2; IGF I-II; EGF; FGF; VEGF Omologhi innesti a base di DBM/BMP Eterologhi E.M.D – Emdogain® Gel BIORA Colloss®; Targobone® Biomet Biologics. Ricombinanti rhPDGF Regranex® J&J rhBMP7 Osigraft® Stryker Biotech rhBMP2 InductOs® Medtronic

3. LA COMPONENTE CELLULARE Staminali (nell’embrione e tessuti adulti) Differenziate (nei tessuti adulti)

CELLULE STAMINALI Le cellule staminali (stem cells, SC) sono cellule non specializzate a uno stadio precoce di sviluppo. Hanno la caratteristica di riprodursi a lungo senza differenziarsi (auto-rinnovamento) e di dare origine a cellule progenitrici dalle quali derivano linee cellulari differenziate (muscolari, ematiche, nervose, ecc...). Possono dividersi e differenziarsi in un largo numero di tipi cellulari che producono i tessuti e gli organi del corpo. Le prospettive terapeutiche aperte dalle SC risultano straordinarie: un primo campo d’applicazione riguarderà la cura di molte patologie gravi (tumori, malattie ereditarie, malattie neuro-degenerative), un secondo campo d’applicazione riguarderà l’impianto di SC per rigenerare cellule e tessuti evitando così i trapianti di organi e i problemi connessi di scarsità dei donatori e di rischio di rigetto per incompatibilità donatore/ricevente

Tipi di CS Dove si trovano Potenzialità Staminali embrionali Staminali Le cellule staminali sono cellule non specializzate in grado di dividersi dando origine contemporaneamente ad una cellula staminale (uguale alla cellula madre) ad una cellula precursore di una progenie cellulare che alla fine darà a sua volta origine a cellule terminalmente differenziate (mature). Tipi di CS Dove si trovano Potenzialità Cellule costituenti la morula Possono originare tutti i tessuti (formazione di un intero organismo):hanno la capacità di differenziarsi in tutte le linee cellulari necessarie a formare l’embrione Nella massa cellulare contenuta all’interno della blastocisti Hanno la potenzialità differenziarsi in qualsivoglia cellula di un animale adulto, ma non di dare origine ad un embrione All’interno di tessuti fetali e adulti differenziati (es. cordone ombelicale, midollo osseo, sangue, fegato, sistema nervoso) Si differenziano in specifici tipi cellulari (ad es. cellule mesenchimali). Hanno la proprietà di moltiplicarsi e mantenersi in coltura, ma sono prive della capacità di rinnovarsi in modo illimitato All’interno di tessuti adulti differenziati – cellule tessuto-specifiche (es. nell’intestino) Possono dar luogo soltanto ad un tipo cellulare Totipotenti Staminali embrionali Pluripotenti Multipotenti Staminali fetali / adulte Unipotenti Staminali adulte

CELLULE STAMINALI ADULTE Presenti nei tessuti adulti Cellule multipotenti che possono essere influenzate dai fattori di crescita (GFs) per differenziare in varie tipologie cellulari mature Ad es. cellule staminali mesenchimali (MSCs) presenti nello stroma del midollo osseo

CELLULE STAMINALI NEL MIDOLLO OSSEO Il midollo osseo è attualmente considerato la fonte più abbondante e facilmente disponibile di cellule progenitrici staminali aventi la capacità di auto-rinnovarsi, proliferare, migrare e differenziare in varie tipologie cellulari mature. In aggiunta alle cellule staminali ematopoietiche, il midollo osseo contiene cellule staminali non-emopoietiche mesenchimali e endoteliali, che costituiscono tre “compartimenti staminali” altamente integrati tra loro.

CONCENTRAZIONE MIDOLLARE FISIOLOGICA MSCs: CONCENTRAZIONE MIDOLLARE FISIOLOGICA In condizioni fisiologiche, il midollo osseo di un uomo adulto contiene mediamente 1 MSC / 250.000 cellule midollari. Questo numero è strettamente correlato all’età: Caplan AI. Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng. 2005 Jul-Aug;11(7-8):1198-211. Review

CONCENTRAZIONE EFFICACE MINIMA MSCs: CONCENTRAZIONE EFFICACE MINIMA E’ stato dimostrato da vari autori che il midollo osseo in toto contiene una quantità di cellule osteoprogenitrici non sufficiente per garantire una rigenerazione ossea efficace. Per avere un adeguato stimolo osteogenico occorre concentrare il midollo 3-4X. OK 3-4X Muschler GF, Matsukura Y, Nitto H, Boehm CA, Valdevit AD, Kambic HE, Davrs WJ, Easley KA, Powell KA. Selective retention of bone marrow-derived cells to enhance spinal fusion. Clin Orthop Relat Res. 2005 Mar;(432):242-51. Ph. Hernigou, MD, A. Poignard, MD, F. Beaujean, MD and H. Rouard, MD. Percutaneous Autologous Bone-Marrow Grafting for Nonunions. Influence of the Number and Concentration of Progenitor Cells. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 2005;87:1430-1437.

AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DI MSCs Il sistema più efficace per concentrare e quindi aumentare il rapporto volume/quantità di MSCs dell’aspirato midollare: CENTRIFUGAZIONE

SISTEMA DI CONCENTRAZIONE Porta ad una elevata concentrazione di cellule midollari in sospensione, quindi iniettabili

IL SISTEMA MARROW STIM Prima Dopo Studi hanno dimostrato che la maggior concentrazione di cellule si ottiene aspirando 2 ml di midollo per sito di prelievo. Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influence of aspiration volume. (Muschler GF, Boem C, Easley K. 1997 - J. Bone Joint Surg. Am. 79:1699-1709)

VALORI DI CONCENTRAZIONE 80% - Recupero della frazione totale di Cellule Nucleate (TNC) 6,7x - Concentrazione di TNC rispetto a quella fisiologica 66% - Recupero della frazione totale di Cellule Mononucleate (MNC) 6,1x - Concentrazione di MNC

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