FASE SPERIMENTALE 1 Rendere le cellule di Escherichia coli OBIETTIVO : LA COMPETENZA Rendere le cellule di Escherichia coli competenti, cioè in grado di far entrare geni estranei attraverso DNA plasmidico Classe 5^ BIO2 Primo Levi

Una cellula è chiamata competente se è in grado di assumere del DNA esogenota e integrarlo nel suo genoma. COMPETENZA NATURALE La competenza è determinata geneticamente: -proteina legante DNA -proteina di competenza -proteina RecA COMPETENZA ARTIFICIALE I batteri non hanno i geni per la competenza e questa viene indotta in laboratorio con tecniche specifiche.

LA COMPETENZA In laboratorio Si vuole aumentare la permeabilità della membrana cellulare Raffreddare le cellule dell’inoculo standardizzato per 10 minuti in ghiaccio tritato Trasferire 2 ml in provetta e centrifugare a 13000 rpm per 2 min Scartare il surnatante e risospendere in CaCl2 e MgCl2 freddo Centrifugare a 13000 rpm per 2 minuti a 4° C Risospendere in CaCl2 freddo Mantenere in ghiaccio Come???

Confronto allo spettrofotometro: Inoculo standardizzato Concentrazione nota Confronto allo spettrofotometro: Standard Turbidimetrico Inoculo Mc Farland max 108 cell/ml ?

Come si ottiene Inoculo standardizzato Inoculare una colonia singola in 20mL di LB broth incubare in agitazione o/n a 37°C Trasferire un’aliquota della brodocoltura o/n in LB broth sterile in beuta, effettuando una diluizione 1:100 (es. 250 mL di inoculo in 25 mL di brodo fresco) e controllare l’assorbanza a λ=595nm. Il valore non dovrebbe essere superiore a 0.05 O.D. Far crescere in agitazione a 37°C da 3 a 4 ore circa. Controllare l’assorbanza a λ=595nm, avendo presente che le cellule vanno raccolte quando la brodocoltura ha raggiunto un’assorbanza a λ=595nm, pari a 0.4 O.D., che corrisponde a circa 108 cell/ml. Se l’assorbanza va bene raffreddare le cellule, incubandole per 10 min in ghiaccio tritato. 5

Il protagonista: Escherichia coli È un Enterobattere coliforme: “Enterico" perché è un componente della flora intestinale; “Coliforme” perché vive nel colon. E’ di forma bastoncellare e aerobio facoltativo; “Gram negativo” in base alla composizione della parete cellulare; E’ oggetto di molti studi e per questo si è a conoscenza dell’intera mappatura genomica (4500 geni)

Ed ora… Passiamo il testimone