Studio biochimico dell’attivazione dei recettori Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio strato lipidico della membrana cellulare. Il sito recettoriale delle molecole idrosolubili è situato sulla parte extracellulare di recettori transmembrana. Molecole segnale lipofiliche attraversano facilmente la membrana cellulare: i loro recettori sono quindi localizzati all'interno della cellula.

Differenti tipi di recettori - Legati alla proteina G - Legati a canali ionici - Recettori steroidei - Recettori legati ad enzimi - Legati alla proteina G

Recettori legati a canali ionici con effetto di tipo: eccitatorio acetilcolina, glutammato, serotonina (apertura dei canali Na+ con conseguente depolarizzazione) inibitorio Gaba, glicina (apertura dei canali Cl- con conseguente iperpoplarizzazione)

Recettori steroidei Gli steroidi sono molecole con elevata lipofilia, in grado di attraversare le membrane plasmatiche e a livello nucleare legandosi a recettori specifici (DNA-binding protein) regolano la trascrizione di un gene adiacente al legame

Recettori legati ad enzimi Quando attivati funzionano direttamente come enzimi (RTK) o sono associati ad enzimi (PTK)

Recettori legati alla G-protein Il ligando endogeno (1) lega specificamente il recettore (2). Viene attivato il sistema G-protein (3). Viene attivato l’adenilato ciclasi (4) che produce il secondo messaggero cAMP (5) a partire dall’ATP (6). Avvengono una serie di reazioni enzimatiche (7) e via fosforilazione (8) il glicogeno (9) viene trasformato in glucosio (10). La fosforilazione può interessare proteine di membrana come canali ionici (11).

Attivazione della Proteine G La G-protein è composta da tre subunità legata quando non attivata al GDP L’interazione ligando recettore attiva la G-protein liberando GDP... Il GTP legato ad a viene idrolizzato a GDP+ P. Le subunità si ricombinano. ..legando GTP. Il trimero si suddivide

+ + R + Gq + Gi R R Gs + - AC DAG Ca++ RS PIP2 IP3 Ca++ Ca++ GTP GDP PK-C + Ca++ RS PIP2 IP3 + Ca++ PL-C R + Ca++ Gq GTP GDP + PK-A ATP cAMP GTP GDP GTP GDP Gi R R Gs + - AC

Sfruttando il meccanismo di attivazione illustrato si può determinare l’attività agonista, agonista inverso, agonista parziale, antagonista. Utilizzando GTPgS35, analogo non idrolizzabile del GTP, si può misurare l’attività di un ligando in base all’accumulo di a-GTPgS35. C H 2 O P 35S N Nel caso in cui il composto sia antagonista è necessario realizzare la curva di attività in presenza di un agonista pieno e verificare lo spostamento parallelo a destra a dosi crescenti di antagonista.

Agonista pieno Agonista parziale ) Agonista inverso S Bound g (GTP 10 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 50 100 Agonista pieno Agonista parziale Agonista inverso log dose Bound (GTP g S 35 )

Dosaggio del secondo messaggero cAMP AP + S S La reazione è basata sulla competizione per l’anti-anticorpo tra cAMP legato alla fosfatasi alcalina e quello libero proveniente dalla stimolazione recettoriale

AP cAMP coniugato alla fosfatasi alcalina Anticorpo primario legato al pozzetto cAMP indotto dall’attivazione Anticorpo secondario recettoriale del ligando La quantità di cAMP cellulare è inversamente proporzionale alla quantità di colorazione gialla svolta.

G-Protein (a, subunità) Attivazione di PK-A Glucagone G-Protein (a, b, g, subunità) Recettore G-Protein (a, subunità) Adenilato ciclasi (inattivo) Fosforilazione di substrati PK-A PK-A inattiva

non fluorescente fosforilato Substrato PK-A-R110 (bisammide Rhodamina 110 peptide) PK-A PK-A R110 non fluorescente fosforilato PK-A R110 non fluorescente proteasi proteasi Eccitazione 485 nm Emissione 530 nM PK-A R110 fluorescente non fluorescente

L’intensità di fluorescenza misurata nel saggio è inversamente correlata all’attività della PK-A 100,000 50,000 FLU 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % peptide fosforilato

Dosaggio del Ca++ intracellulare IP2 Gq-a IP3 DAG Proteina kinasi C inattiva REL Proteina kinasi C Calmodulina-proteina Kinasi (inattivoa) Calmodulina-proteina Kinasi

Dosaggio del Ca++ Saggio dell’Aequorina L’Aequorina è una fotoproteina riscontrata nella medusa Aequorea Victoria. L’apoaequorina è una proteina di 21 KDalton e necessita di un gruppo prostetico idrofobico coeletranzina per essere convertita nella forma enzimatica attiva: aequorina.

In presenza di Ca++ aequorina ossida la coeletranzina in coelentramide con produzione di CO2, ed emissione di luce. Questi saggi vengono effettuati in linee cellulari stabili in grado di esprimere il GPCR ed apo-aequorina

Sistemi di modulazione del segnale Oltre a sistemi di attivazione recettoriale e di amplificazione del segnale sono presenti meccanismi di interruzione del segnale Autoregolazione del rilascio del neurotrasmettitore (feedback negativo) Questo meccanismo si realizza mediante recettori presinaptici che possono essere controllati dallo stesso neurotrasmettitore (autorecettori) o da un neurotrasmettitotre differente (eterorecettori)

Sistemi enzimatici preposti alla degradazione Sistemi di recupero del neurotrasmettitore Desensitizzazione recettoriale (in recettori accoppiati alla G-protein) La desensitizzazione può essere: omologa (specifica per un recettore) oppure eterologa (non specifica); rapida (~ 20 minuti) oppure lenta (giorni); perdita funzione recettoriale (uncoupling) o con diminuzione dei recettori (down-regulation)

Uncoupling del recettore (desensitizzazione rapida) La fosforilazione non altera la capacità del recettore di attivare la G-protein ma aumenta l’affinità del recettore fosforilato per la proteina b-arrestina che inibisce l’interazione del recettore con la G-protein determinando il disaccoppiamento).

Uncoupling del recettore (desensitizzazione lenta) Molti sistemi recettoriali sono fosforilati dai loro stessi enzimi effettori PKA e PKC Questo tipo di fosforilazione è un feedback diretto negativo che al tempo stesso sopprime l’attivazione dell’enzima effettore PKA. Questo meccanismo di desensitizzazione è eterologo in quanto l’attivazione di PKA PKC è sufficiente a determinare la fosoforilazione del recettore. La desensitizzazione da PKA è più lenta ma è molto più sensibile alla concentrazione di agonista.

Saggi funzionali su organo isolato In questi esperimenti in seguito ad uno stimolo (farmacologico o elettrico) deve essere apprezzabile e misurabile una risposta in un preparato biologico L’effetto che si dovrà valutare può essere rappresentato da: variazione di lunghezza o di tensione del preparato biologico variazioni del volume del preparato biologico che viene valutato mediante semplici registratori a galleggiante variazioni di pressione

La stimolazione del preparato biologico può essere effettuata Elettricamente In alcuni esperimenti può essere necessario stimolare elettricamente il preparato. La forma e la durata degli impulsi sono parametri importanti soprattutto in preparati neuromuscolari. Farmacologicamente Le concentrazioni di farmaco necessarie in questo tipo di esperimento sono molto basse anche perché quando impiegati a dosaggi elevati sono dotati di vari effetti ed è quindi importante scegliere quelle concentrazioni alle quali agiscono in modo specifico.

dell’attività caratterizzata Esperimenti farmacologici Qualitativi Quantitativi Quantizzazione dell’attività caratterizzata Studio del meccanismo di azione Agonisti producono effetti attivi o diretti sui preparati biologici Antagonisti producono effetti negativi o indiretti e inibizione o alterazione degli effetti degli agonisti

Curva dose-risposta di un agonista pieno Effetto massimo Effetto massimo percentuale Log dose In rosso la curva dose-risposta dell’agonista. In nero le curve dose risposta dell’antagonista in presenza di dosi crescenti di antagonista.

carbacolo 1 mM in presenza di 0.1 mM di atropina Risposta dell’ileo di cavia ad una dose di carbacolo dose dose carbacolo 1 mM in presenza di 0.1 mM di atropina carbacolo 1 mM

Attività pre- post- giunzionale Impulso elettrico Contrazione Agonista pre- Un agonista pre- è in grado di ridurre il rilascio di mediatore chimico successivo alla stimolazione elettrica. Es: 8-OH-DPAT sui recettori serotoninergici 5-HT1A nella vescica o ileo di cavia

Es: carbacolo su recettori muscarinici nell’ ileo di cavia Agonista post- Un agonista post è in grado di attivare autonomamente l’effetto biologico Es: carbacolo su recettori muscarinici nell’ ileo di cavia