PROBLEMI EMERGENTI NELLA VALUTAZIONE DEL RISCHIO MICROBIOLOGICO Prof. Antonello Paparella Dipartimento di Scienze degli Alimenti Università degli Studi di Teramo Cremona, 15 ottobre 2004

2002: ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) Transizione dai sistemi HACCP alla QRA (Analisi quantitativa del rischio) solo per problemi sanitari rilevanti e matrici alimentari complesse applicazione integrata di HACCP, QRA e GHP ridimensionamento e qualificazione del controllo ufficiale definizione degli Obiettivi di sicurezza alimentare (FSO)

FSO (Food Safety Objective) massima frequenza e/o carica di microorganismi di interesse sanitario o concentrazione di tossine al momento del consumo

Evoluzione del mercato degli alimenti: da unbranded commodities a convenience foods Tendenze nella tecnologia alimentare: applicazione estensiva di tecnologie in nuovi settori (merchandising) Estensione della vita di scaffale (ESL) Mild technologies (minimally processed foods)

Innovazione tecnologica: nuovi rischi microbiologici? Salagione per microiniezione in prodotti non trattati termicamente

Innovazione tecnologica: nuovi rischi microbiologici? Semilavorati critici: carni separate meccanicamente, prodotti ricomposti, prodotti semicotti, ecc.

Innovazione tecnologica: nuovi rischi microbiologici? Distributori automatici di piatti pronti

Innovazione tecnologica: nuovi rischi microbiologici? Vendita in rete di prodotti deperibili

Valutazione del rischio microbiologico: impatto della biodiversità dei microrganismi QRA: richiede piani sperimentali mirati allo studio della sopravvivenza/sviluppo di specifici ceppi microbici Scelta dei ceppi: condiziona il rapporto tra valori predetti e valori misurati Mild technologies: la risposta dei microrganismi ai danni subletali può essere notevolmente diversa tra ceppi e individui

Dose infettante: 1 ufc g –1 (ICMSF, 2002) Sopravvivenza ai processi della tecnologia alimentare: patogeni ad elevata classe di rischio VTEC (E. coli verocitotossico o SLT): sopravvivenza a pH 3,9 (sidro, salame, maionese, ecc.) SINDROME UREMICA EMOLITICA INSUFFICIENZA RENALE ACUTA IN ETA’ PEDIATRICA Dose infettante: 1 ufc g –1 (ICMSF, 2002)

Ricontaminazione post processo: patogeni emergenti Enterobacter sakazakii: contaminazione di alimenti a bassa aw (latte in polvere) MENINGITE E SETTICEMIA NEL NEONATO rara ma letale (tasso letalità 33-80%) segnalata correlazione epidemiologica con latte in polvere Kandhai et al 2004: positività 9-35% in campioni ambientali da 100% stabilimenti di produzione (n=4). Positività 31% in campioni prelevati da 16 nuclei familiari.

Contaminazione di alimenti consumati crudi Vibrio vulnificus in OSTRICHE: può diventare vitale non coltivabile (VNC) senza perdere la virulenza (Olivier and Bockian 1995) Abbattimento Viable Count dopo riduzione temp. a 5°C: 6D Carica effettiva: >1 x 105 VNC ml-1 Prova biologica positiva (topo) Effetto ac.citrico 1-10% e succo limone 50-100% (Borazjani et al 2003): abbattimento 4D ma sopravvivono >3 MPN g-1 Ieri patologia professionale Oggi tossinfezione alimentare Tendenzialmente ribelle al trattamento

“Patologie da frigorifero” Listeria monocytogenes in CASI DI LISTERIOSI SPORADICA Canada (Farber et al 2000) – Nel frigorifero dei 2 pazienti: contaminazione da L.m. sierotipo 1/2b in surimi, olive nere, insalata di pasta, ragù e maionese. Surimi: 2,1 x 109 ufc g-1 Olive nere: 1,1 x 107 ufc g-1 Insalata di pasta: 1,3 x 106 ufc g-1 Correlazione epidemiologica con surimi Olive nere substrato non permissivo… …MA CONTAMINATO!!

Rischi derivanti da innovazioni tecnologiche Siringatura per microiniezione e biodiversità di L.monocytogenes nel salmone affumicato Paparella et al 2003

SIRINGATURA PER MICROINIEZIONE Possibile fonte di contaminazione da L. monocytogenes, a causa del ricircolo della salamoia e/o della formazione di biofilm (soprattutto in prodotti non destinati a cottura!!)

BIODIVERSITA’ DI LISTERIA MONOCYTOGENES Gli stress applicati all’ecosistema microbico esaltano le differenze di comportamento tra gli isolati Non tutti gli isolati manifestano lo stesso potenziale di sopravvivenza e sviluppo!!!!

Evoluzione di isolati di L Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine: industria del salmone) a 6°C in due substrati: BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee tratteggiate) Paparella et al 2003

Evoluzione di isolati di L Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine: industria del salmone) a 9°C in due substrati: BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee tratteggiate) Paparella et al 2003

Effetto dell’aggiunta di estratto di lievito (3% in SBm3; 10% in SBm10) al Brodo di Salmone (SB): ceppo LM16 Paparella et al 2004

Biodiversità in isolati di L Biodiversità in isolati di L.monocytogenes provenienti dall’industria del salmone M e 7 = ceppi ATCC CEPPI SALAGIONE TRADIZIONALE: 50 (2103 b1), 39 (2103 b4), 26 (2103 b6) CEPPI MICROINIEZIONE: 31 (641/7 I), 13 (648/2 I), 48 (648/7 I) CEPPI AMBIENTALI: 34 (LM 16), 29 (LM37) Paparella et al 2004

BIODIVERSITA’ NELLA DIVERSITA’ Valutazione della sopravvivenza di una popolazione di L.monocytogenes in un prodotto con fisiologica eterogeneità merceologica (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)

EFFETTO MATRICE NEI PRODOTTI A BASE DI CARNE IMPANATI PREFRITTI: RUOLO DEL GRASSO (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002) Figure 1 – Evolution of dynamometric index and survival curves of Listeria monocytogenes inoculated in poultry meat added with different percentages of fat and collagen 7

EFFETTO MATRICE NEI PRODOTTI A BASE DI CARNE IMPANATI PREFRITTI: RUOLO DEL COLLAGENE (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002) Figure 2a – Survival curves of Listeria monocytogenes inoculated in poultry meat added with 8% fat and 3% collagen Figure 2b – Survival curves of Listeria monocytogenes inoculated in poultry meat added with 8% fat and 6% collagen 7

I LIMITI DELL’ESAME BATTERIOLOGICO: LE CELLULE VITALI NON COLTIVABILI Cellule VNC: condizione di vitalità con perdita di coltivabilità (viable not culturable) Strategia di sopravvivenza in batteri non sporigeni. Dimostrata in Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Vibrio, Streptococcus, Micrococcus ma anche in sporigeni come Bacillus subtilis. Riduzione volumetrica da forme coccobastoncellari a piccoli corpi sferici non dotati di involucri.

TRANSIZIONE DA VNC A COLTIVABILE E VICEVERSA Passaggio a VNC indotto da: carenza di nutrienti, cambiamenti di temperatura (es. refrigerazione), esposizione ad ipoclorito o modificazioni nella % NaCl. Ripristino della coltivabilità (“resuscitation”): può essere indotto da un aumento della temperatura o da un graduale incremento della % nutrienti (NO TERRENO DI ARRICCHIMENTO!).

Alla ricerca delle VNC… Metodi per stimare la vitalità cellulare DEFT (Jakobsen et al 1984; Ruocco et al 1991) Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et al 1999) Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et al 1997) Bioscreen/Turbidometria(Phillips et al 1998;Paparella et al 2003) CO2 detection time in GC (Guerzoni et al 1985) Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)

METODO DEFT (Direct Epifluorescence Filter Technique) Principio: i microorganismi, filtrati su membrana, trattati con fluorocromo ed osservati in epifluorescenza, assumono colore in funzione di RNA e permeabilità della parete Utilizzando l’arancio di acridina, le cellule vitali assumono una colorazione giallo-arancio mentre quelle inattivate appaiono verdi

METODO DEFT Parametro: n° cellule in almeno 15 campi microscopici U.M.: numero DEFT (batteri vitali) Tempo di analisi: 30 min Sensibilità (con risposta lineare):5 x 103-1 x 104ufc g-1 Correlazione con metodi tradizionali: R=0,89 (Ruocco, 1991), R=0,99 (Jakobsen, 1984) Varianti: manuale ed automatico

DEFT:BIOFILM DI LISTERIA MONOCYTOGENES

Studio del danno acido e termico in L Studio del danno acido e termico in L.monocytogenes con citometria di flusso (Petrova and Donnelly 2004) DOPPIA COLORAZIONE: Carbossifluoresceina diacetato (cFDA) attività esterasica Propidio ioduro (PI) danno di membrana L.monocytogenes, esposta a diversi trattamenti termici e acidi, si divideva in 3 sottopopolazioni: VITALE: cFDA-positiva DANNEGGIATA: PI-positiva e cFDA-positiva INATTIVATA: PI-positiva

Studio del danno da olio essenziale in L Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et al 2004) AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO: Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile) formazano (rosso, insolubile) Valutazione quantitativa della vitalità cellulare (deidrogenasi) - usata in studi di fisiologia vegetale - Numerosi ceppi di L.monocytogenes sono stati esposti a diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo screening, con TTC.

Studio del danno da olio essenziale in L Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et al 2004)

Paparella et al 2004

BIOCONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI Tecnologie per la prevenzione della contaminazione e dello sviluppo di microrganismi negli alimenti, attraverso l’uso di: sostanze antimicrobiche naturalmente presenti negli alimenti sostanze antimicrobiche prodotte negli alimenti dopo stimolazione fisica o chimica, oppure in seguito all’aggiunta di colture microbiche protettive

Colture protettive Colture microbiche che possono essere aggiunte agli alimenti al fine di inibire microrganismi indesiderati, senza modificare le caratteristiche tecnologiche e sensoriali del prodotto Invece, nelle colture starter, la modificazione delle caratteristiche fisico-chimiche è desiderata

Inibizione da LAB verso L. monocytogenes

Listeria monocytogenes Valutazione dell’antagonismo tra LAB e Listeria monocytogenes (tutti isolati da salmone affumicato) LAB Listeria monocytogenes   641/6 II 2103 b1 2103 b6 648/7 II 641/7 I 648/2 I 659/4III A 202 - ++ +++ A 203 A 205 A 211 A 213 B 202 B 213 LAT 5 LAT 7 + LAT 8 LAT 12 LAT 15 LAT 16 LAT 22 LAT 28 LAT 31 LAT33/2 LAT 35 LAT 38 LAT 40 Paparella et al 2003

BIOCONSERVAZIONE CON OLII ESSENZIALI In genere: NO Residui tossici SI Modifica sensoriale Interesse verso olii dearomatizzati o efficaci a bassa conc. Meccanismo di azione non sempre conosciuto Componenti idrofobici di alcuni olii essenziali possono oltrepassare la parete dei Gram neg. attraverso le porine (Helander et al 1998) per poi modificare la permeabilità di membrana con effetti letali (Lambert et al 2001)

Azione selettiva degli estratti vegetali Paparella et al 2004

Influence of sage EO on the survival of Staphylococcus spp. Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al 2004) Influence of sage EO on the survival of Staphylococcus spp.

Influence of rosemary EO on the survival of Staphylococcus spp. Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al 2004) Influence of rosemary EO on the survival of Staphylococcus spp.

Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al 2004) *Mean  SD.; **No viable cell growth was detected (detection limit: 10 cfu mL-1)

CONCLUSIONI QRA: richiede ingenti risorse economiche ed un notevole sviluppo culturale delle imprese alimentari L’innovazione tecnologica può risolvere oppure creare nuovi rischi alimentari

CONCLUSIONI La gestione dei rischi alimentari deve fare i conti con la biodiversità dei microrganismi Sarebbe necessario promuovere la collezione e caratterizzazione dei ceppi microbici più significativi per la produzione alimentare (utili – degradativi –patogeni)

CONCLUSIONI La bioconservazione degli alimenti può offrire interessanti opportunità per uno sviluppo sostenibile della tecnologia alimentare

Grazie per l’attenzione!