Fisiopatologia del Sistema Immunitario Modulo di Biochimica 1 e 2 – Le molecole del sistema immunitario: Ig, MHC, TCR 3 – Il Complemento 4 – Citochine e Recettori Tiziana Alberio tiziana.alberio@uninsubria.it c/o Lab. di Biochimica e Proteomica Funzionale, 1° piano

1- Struttura delle Immunoglobuline Le molecole del Sistema Immunitario 1- Struttura delle Immunoglobuline

Riconoscimento dell’antigene Regioni variabili Riconoscimento dell’antigene Regioni costante funzione effettrice Nucleo strutturale simmetrico: 2 catene leggere 24 kDa 2 catene pesanti 55 o 70 kDa Ponti disolfuro Catena leggera Catena pesante

Catene leggere (L) e pesanti (H) CL VL hinge CH1 VH CH2 La struttura della molecola è garantita da: Interazioni non covalenti tra domini Ig Ponti disolfuro tra L e H e tra le regioni C di H (cerniera) Sovrapposizione “perpendicolare” forze idrofobiche Rigidità costanti H Ponti disolfuro cerniera flessibilità Fab CH3

Struttura generale di un anticorpo Riconoscimento dell’antigene e funzioni effettrici: funzioni spazialmente separate e indipendenti

Esperimenti di clivaggio proteolitico cerniera: zona più suscettibile all’attacco proteolitico (tra Cγ1 e Cγ2) La proteolisi con papaina genera: Fab antigen-binding, mantiene la capacità di legare l’Ag Fc, frammento cristallizzabile La proteolisi con pepsina interessa la regione C-term della cerniera e genera: Fab’ (Fab+cerniera) F(ab’)2 se vengono mantenuti S-S Porter con IgG di coniglio Proteolisi limitata Fab e F(ab’)2 utili sperimentalmente: legano l’Ag ma non hanno funzione effettrice

Il dominio immunoglobulinico ≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente 2 strati di foglietto β planare (β sandwich) ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.) antiparalleli motivo a chiave greca Stabilizzato da: ponti disolfuro interazioni idrofobiche tra i due foglietti β Conservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)

La superfamiglia delle immunoglobuline Ab tutte le molecole che contengono il dominio Ig; mediano funzioni di riconoscimento, adesione e legame omologia di sequenza tutti i geni che codificano per domini Ig si sono evoluti da un gene ancestore comune Evento precoce: duplicazione genica, con divergenza esoni V e C. Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e TCR (sequenza). 2- Capacità di riarrangiare il DNA (per riconoscimento Ag) La funzione dipende dall’interazione tra domini Ig MHC TCR

C e V in catene leggere (L) e pesanti (H) V= N-term C= C-term H: V → 1 dominio C → 3 o 4 domini L: V → 1 dominio C → 1 dominio V: la sequenza a.a. differenzia gli Ab prodotti da un clone di linfociti B

Segmenti ipervariabili o CDR Complementarity Determining Region: ≈ 10 a.a. CDR3 il più variabile N-term C-term

Regioni ipervariabili o CDR Le CDR formano delle anse esposte sulla superficie, strutture chimiche uniche → SPECIFICITA’ Sequenze conservate adiacenti → ripiegamenti del dominio Ig

Cause della diversificazione 1) Ricombinazione somatica del DNA: diversità combinatoria Organizzazione genomica nei geni delle catene leggere e pesanti nell’uomo Diversi esoni per i diversi domini H 10 alla 9 Ab differenti L H

Cause della diversificazione 2) Diversità giunzionale Catena H Catena L Segmenti regione V 1000 300 Segmenti regione D 15 - Segmenti regione J 4 Diversità giunzionale +++ + Inserzione regione N ++ Mutazione Somatica totale 1000x15x4= 6 x 104 300x4= 1.2 x 103 associazione 7.2 x 107 Elisione di nucleotidi (nucleasi) 3) Inserzione della regione N TdT Transferasi deossiribonucleotidica terminale V J OH GTCAATG TdT inserisce nucleotidi Rottura del DNA + Ligazione Introne

Classi o isotipi delle Ig 5 classi, che si differenziano per la regione C della catena pesante: IgM  Catena m IgD  Catena d IgG  Catena g IgA  Catena a IgE  Catena e 4C uguale sequenza a.a. all’interno della stessa classe o sottoclasse 3C 3C 3C 4C Sottoclassi IgG1  Catena g1 IgG2  Catena g2 IgG3  Catena g3 IgG4  Catena g4 IgA1  Catena a1 IgA2  Catena a2 Diverse funzioni EFFETTRICI

Classi delle Ig

Funzioni Effettrici Porzione Fc 1- viene riconosciuta da specifici R 2-può attivare il complemento 3- permette il trasporto attivo dell’Ab (latte, secrezioni, circolo fetale...)

IgM e IgA formano polimeri IgM e IgA possono formare multimeri Le IgM formano pentameri nel plasma Le IgA formano dimeri nelle secrezioni mucose (necessario per il trasporto attraverso gli epiteli) Contengono una coda C-term di 18 a.a. con un residuo Cys necessario alla polimerizzazione Un polipeptide aggiuntivo (J: joining) di 15 kDa favorisce la polimerizzazione legando la Cys

Lo switch isotipico Nel corso delle risposte umorali, il clone di linfociti B stimolato dall’Ag può produrre anticorpi di isotipo diverso (switch isotipico): CH cambia V, e quindi la specificità, no VDJ riarrangiato si collega ad un gene C più a valle e il DNA frapposto viene eliminato Regioni di scambio, 5’ di ciascun locus CH con sequenze ripetute altemente conservate

Lo switch isotipico Linfocita B maturo: contemporanea espressione sulla membrana di IgM e IgD, mediante splicing alternativo e poliadenilazione selettiva Occupazione di CD40 Citochine Linfocita B attivato: a seconda dello stimolo potrà produrre IgE, IgA o IgG

Classi o isotipi delle Ig 2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione C-term della catena leggera: κ λ Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λ Cκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ Non sono note differenze funzionali 60% κ e 40% λ nell’uomo

Sito di legame per l’antigene Ag VL+ VH 2 per ogni molecola di anticorpo VL VH Ab

Legame all’antigene La flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione CERNIERA) permette il legame a porzioni di antigeni multivalenti distanti Cerniera: ≈ 10/60+ a.a. La sequenza assume una conformazione casuale; la molecola fa una torsione tra CH1 E CH2 La flessibilità è influenzata anche dalla capacità di VH di ruotare attorno a CH1

Legame all’antigene Legame reversibile e non covalente Il contributo di ciascuna forza dipende dalla struttura del sito di legame e da quella del determinante antigenico AFFINITA’: forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 10-7 e 10-11 M. AVIDITA’: forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico) (rilevante per IgM)

L’Ab come Ag isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le immunoglobuline dello stesso isotipo di una specie allotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie. Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la regione C (polimorfismi) idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la regione V dell’Ig