Micelle Polimeriche Copolimeri: dove vi è una catena polimerica formata da diversi monomeri (diverse unità ripetenti). In funzione della struttura posso riconoscere: copolimeri alternati -ABABAB- ovvero –(AB)n- copolimeri a blocchi –BBBAABBBAA- ovvero –An-Bm- copolimeri statistici -BBBAAAABBABB- copolimeri ad innesto Copolimeri a blocchi (- A(n)-B(m)-) con caratteristiche anfifiliche dispersi in mezzo acquoso in opportune condizioni e concentrazioni tendono ad auto-assemblare spontaneamente formando micelle polimeriche. Le micelle polimeriche hanno un’unica struttura “nucleo-parete” (in inglese “core-shall”) nella quale il core o nucleo interno funge da nano-contenitore di farmaci circondato da un parete polimerica idrofilica. ……Per la formazione di micelle polimeriche verranno sintetizzati ed impiegati copolimeri ad esempio con una struttura diblocco A-B dove A è idrofilico (che formerà la parete) mentre B è un polimero idrofobico (formerà il core).

Il nucleo idrofobico è in genere formato da polimeri biodegradabili come il PBLA (poli(-benzil-L-aspartato)) o il PDLLA (poli(DL-acido lattico)) o PCL (poli--caprolattone), ma anche da polimeri solubili in acqua resi insolubili da modificazioni chimiche o dall’interazione con il farmaco (es. P(Asp) che è l’acido poliaspartico), o polimeri non o lentamente biodegradabili (es. polistirene o polimetilmetacrilati) che però devono essere completamente eliminati dall’organismo (limite è il PM). Il polimero che forma la struttura esterna (parete) è in genere un polimero biocompatibile idrofilico come il PEG (polietilenglicole) o il PEO (polietilenossido) che stabilizza la micella polimerica nella circolazione sistemica e che se opportunamente modificato può direzionare la struttura micellare verso uno specifico target cellulare.

Formazione delle micelle polimeriche La micella polimerica è la risultante di due forze; una attrattiva che guida l’associazione delle molecole e l’altra repulsiva che previene la crescita indiscriminata della micella in una fase macroscopica diversa. A basse concentrazioni i copolimeri esistono in catene singole. Quando la concentrazione aumenta fino ad un valore definito CMC (concentrazione micellare critica), le catene macromolecolari associano formando aggregati micellari. Per la formulazione di micelle polimeriche per la veicolazione ed il direzionamento di farmaci vengono utilizzati copolimeri a blocchi con CMC bassa (10-6, 10-7 M). Co-polimeri con CMC alte sono instabili in mezzo acquoso e dissociano facilmente e rapidamente dopo diluizione.

Interazione micella polimerica- farmaco; caricamento del farmaco coniugazione chimica che prevede l’instaurarsi di un legame covalente tra farmaco e polimero idrofobico (es legame ammidico, estereo etc…) interazione elettrostatica (es. tra acidi nucleici e polimeri con carica opposta-polioni) intrappolamento fisico attraverso tecniche quali la dialisi e l’emulsione/evaporazione del solvente DIALISI Il farmaco e co-polimero sono solubilizzati nello stesso solvente (es etanolo, dimetilformammide) mentre nell’altro contenitore, al di la della membrana dializzante, viene posto un solvente selettivo solo per la porzione idrofila del copolimero. Quando il solvente di farmaco e polimero è rimpiazzato dal solvente selettivo, la porzione idrofobica del co-polimero tende ad associare formando il core micellare che, durante il processo, incorpora il farmaco insolubile. EMULSIONE/EVAPORAZIONE DEL SOLVENTE Viene preparata un’emulsione O/W. Il co-polimero viene disperso in solvente acquoso. Il farmaco è solubilizzato in solvente organico volatile ed aggiunto alla soluzione acquosa di polimero. Dall’emulsione, per evaporazione del solvente organico si ottengono micelle polimeriche.

La capacità di veicolare e direzionare farmaci è influenzata da: la scelta del co-polimero Tipo di co-polimero influenza il caricamento del farmaco, PM influenza dimensioni del carriers, la velocità di escrezione glomerulare, la CMC stabilisce la stabilità della micella polimerica somministrata ed in particolare la velocità di dissociazione delle micelle in singole catene; la micella somministrata deve mantenere la sua integrità per un tempo sufficiente da giungere al target e rilasciare il farmaco, la viscosità del core micellare influenza la stabilità fisica ed il rilascio del farmaco - l’interazione micella polimerica –farmaco influenza la distribuzione del farmaco nella micella, il meccanismo di rilascio, la velocità di rilascio. Occorre valutare anche la concentrazione iniziale di farmaco aggiunto; questa influenza l’efficienza di caricamento e lo stato del farmaco nella preparazione (cristallino od amorfo). - le dimensioni micellari e l’indice di polidispersione se comprese tra 10 e 100 nm, consentono al sistema di extravasare con facilità e di infiltrarsi nei tessuti; permettono la sterilizzazione per semplice filtrazione e minimizzano i rischi di embolie dopo somministrazione. Le dimensioni sono influenzate da: PM del co-polimero,proporzione tra porzione idrofilica ed idrofobica e numero di aggregazione - modificazioni della micella polimerica A) con co-polimeri integrati con particolari funzioni sensibili a particolari pH o substrati di particolari enzimi B) con molecole ligando specifiche per un direzionamento attivo

Perché le micelle polimeriche?

Targeting passivo: Dopo somministrazione endovena le micelle mostrano un prolungamento della emivita plasmatica a seguito della rallentata escrezione renale e del limitato uptake macrofagico Le micelle polimeriche tendono ad accumularsi in tessuti infiammati o tumorati ed ad infiltrare. Il farmaco viene rilasciato direttamente dalle micelle (per diffusione/attraversamento delle catene, o a seguito di reazioni chimiche o di particolari stimoli) o a seguito della dissociazione delle micelle in catene libere.

Es: co-polimero PEG-b-P(Asp) chimicamente coniugato con Dox forma spontaneamente micelle polimeriche con diametro di 15-60 nm. Queste micelle (NK911) che efficacemente incorporano Dox sono attualmente in trials clinico (fase II) in Giappone. In questa formulazione la Dox chimicamente coniugata alla catena polimerica è farmacologicamente inattiva ma contribuisce al caricamento stabile per incorporazione fisica di altra DOX libera nel cuore micellare che giustifica la velocità di rilascio del farmaco nei tessuti tumorati. Altri composti idrofobici come l’amfotericina B e la spicamicina sono state efficacemente incorporate in micelle polimeriche di PEG-b- P(Asp).

Es: Il cisplatino (CDDP) è un agente antitumorale molto efficace ed utilizzato. L’uso clinico è limitato dalla nefrotossicità e dall’instaurarsi di gravi effetti neurotossici. In più il CDDP ha una breve emivita plasmatica con rapida escrezione renale. Sono state formulate micelle polimeriche per la veicolazione del CDDP. Sono stati utilizzati co-polimeri a blocchi quali PEG-b-P (Asp) e PEG- b- P(Glu). La formazione delle micelle con farmaco incorporato è basata sulla sostituzione del Cl- del farmaco (complesso metallico) con il COO- del copolimero a blocchi. La micella che si origina è stabile in acqua distillata mentre si inverte la sostituzione in soluzione salina (0,15 M NaCl), con rilascio del farmaco (in circa 10 ore-cinetica lenta). Studi hanno dimostrato buon accumulo nel tumore solido (20 volte > al CDDP libero), riduzione di nefro e neurotossicità. Dopo somministrazione si è osservato il rilascio del farmaco dalla micella in circa 10 h (cinetica lenta).

Liposomi “Peghilati” Micelle polimeriche Discreti tempi di circolazione (t1/2= 48 h) Buona capacità nel controllare e rilasciare il farmaco Diverse formulazioni in commercio (Doxil, Ambisome, Visudyne etc.) Si conoscono effetti collaterali dati dalla somministrazione di liposomi pegilati; es “hand-foot syndrome” dopo somministrazione del DOXIL Del Doxil così come di altre formulazioni si conosce l’efficacia terapeutica. Si impiega con successo nel cancro ovarico ed alla mammella mentre mostra poca efficacia in alcuni tumori quali quello al polmone ad allo stomaco. I liposomi peghilati con dimesioni prossime a 150-200 nm penetrano con difficoltà i tessuti, un a volta extravasati localizzandosi prevalentemente attorno al vaso. Nei liposomi peghilati ho limiti nell’incapsulazione di farmaci idrofobici. Grosse quantità possono portare alla rottura del sistema LIMITE- Stabilità durante la preparazione e nella somministrazione Micelle polimeriche Tempi di circolazione ma inferiori ai liposomi peghilati (t1/2= 24 h) Buona capacità nel controllare e rilasciare il farmaco (attraverso la risposta a diversi stimoli o ambienti) Nessuna formulazione in commercio NK911 in trials clinico, pur su un numero inferiore di pazienti rispetto al trattamento con Doxil, ha mostrato buona risposta antitumorale e assenza di effetti collaterali Le micelle polimeriche con diametro inferiore a 100 nm hanno ottime capacità infltranti e tendono a localizzarsi meglio nel tessuto rispetto ai liposomi peghilati (in molti tumori solidi) Le micelle polimeriche incorporano efficacemente e stabilmente vari farmaci idrofobici. LIMITE- la stabilità del sistema dopo somministrazione. Pochi studi attualmente disponibili sull’interazione con le cellule

Le micelle polimeriche sono formulate con co-polimeri con particolari funzioni ad esempio sensibili a variazioni di temperatura e pH, così da controllare il rilascio del farmaco solo in determinati tessuti o cellule. Es.: recentemente sono state sviluppate micelle polimeriche pH sensibili dove la DOX è coniugata al copolimero attraverso un legame acido labile (coinvolgimento di uno spacer-idrazone): Il sistema è destabilizzato nei compartimenti acidi (es endosomi-lisosomi; ambiente extracellulare tumorale). Il preparato ha mostrato stabilità in circolo, buona capacità nel raggiungere il sito tumorato e rilasciare il farmaco

Targeting attivo: per avere un rilascio selettivo occorre un sistema stabile in circolo, abile nell’extravasare, nel permanere nel sito target, interagire con la cellula specifica, essere internalizzato e rilasciare il principio attivo. Il co-polimero, ed in particolare la porzione polimerica idrofila può essere modificata con molecole ligando selettive che promuovono un direzionamento sito specifico Es. : le micelle polimeriche pH sensibili dove la DOX è attaccata al copolimero attraverso un legame acido labile (coinvolgimento di uno spacer-idrazone) sono state modificate con molecole ligando specifiche. In particolare il copolimero è stato modificato con folato per favorire l’interazione con le cellule tumorali

Polyion complex (PIC) micelles - copolimeri PEG-b- policationi (es PEG-b-PLL) + DNA (interazione elettrostatica)= PIC (piccole dimensioni, basso potenziale superficiale, eccellente stabilità all’interazione con le proteine plasmatiche) il segmento polimerico PLL può essere modificato con gruppi tiolici così da ottenere una reticolazione nel core per formazione di legami disolfuro che vengono scissi selettivamente a livello citoplasmatico, dove si ha una concentrazione elevata di glutatione. Questa modificazione stabilizza il sistema e permette un miglior controllo sul rilascio (velocità e sito) dell’attivo. PIC modificate con molecole ligando selettive (recentemente al PEG è stato legato del galattosio per direzionare ad epatociti). per favorire l’escape endosomiale sono state formulate micelle polimeriche con copolimeri a tre blocchi A-B-C. Il blocco A è PEG (porzione idrofila esterna), il blocco C è PLL (policatione interno che forma il core e che interagisce con il materiale genico). Tra queste due porzioni ho un terzo polimero che presenta un basso valore di pKa e che mostra abilità nel destabilizzare l’endosoma acido (ha un effetto tamponante l’acidità che destabilizza l’endosoma). Buoni risultati dopo i primi studi in vivo.

DENDRIMERI Sono nanostrutture con un’architettura dendritica, stabili e monodisperse, ovvero macromolecole polimeriche caratterizzate da ramificazioni che radialmente si estendono da un nucleo centrale; sono caratterizzati da un punto di vista strutturale da tre zone fondamentali: la prima è il ‘core’, vi è poi una parte intermedia con le ramificazioni secondarie che partono dal core e infine una zona più esterna dove si trovano le celle terminali che possono dare origine alle ramificazioni successive e definire la generazione del dendrimero stesso. In virtù della struttura interna caratterizzata da spazi vuoti e della zona esterna più densa questi sistemi possono veicolare e direzionare farmaci [sistemi guest-host (ospite- ospitante) e coniugazione del farmaco. ]

Sintesi dei dendrimeri Processo divergente (introdotto da Tomalia) (A) Divergent approach using “lego” chemistry towards highly functionalized phosphorous dendrimers. (B) Convergent approach towards triazole dendrimers using “click” chemistry: a) CuSO4 (5 mol%), sodium ascorbate (10 mol%), H2O/tBuOH (1 : 1); b) 1.5 equiv. NaN3, CH3COCH3/H2O (4: 1), 60 8C, 1–3 h. (Reproduced with permission from Ref. [19], American Chemical Society 2003; and Ref. [20], Wiley-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim, 2004.). Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 2106– 2129 Sintesi dei dendrimeri Processo divergente (introdotto da Tomalia) “Lego” chemistry Processo convergente (introdotto da Hawker e Frèchet) “Click” chemistry

Una grande famiglia sintetizzata con metodo divergente è rappresentata dai dendrimeri di tipo PAMAM (poliamidoammina). La crescita, lo sviluppo delle diverse generazioni, avviene radialmente e i gruppi superficiali vengono amplificati esponenzialmente ad ogni generazione. I dendrimeri di tipo poliamidoammina (PAMAM) si comportano da polielettroliti, in quanto i gruppi terminali di tipo ammina primaria, unitamente ai gruppi amminici terziari che si ritrovano all’interno della struttura, sono suscettibili di estensiva protonazione anche in condizioni fisiologiche. Pertanto, variazioni di forza ionica e di pH costituiscono un modo conveniente per controllare il grado di protonazione (e quindi la carica positiva), le interazioni interne e conseguentemente anche la struttura (la flessibilità) di questi polimeri. Variazioni di forza ionica e pH sono alla base dell’impiego di queste macromolecole come carrier di piccole molecole (ad esempio farmaci) all’interno di cavità strutturali e del rilascio controllato di queste in seguito a diversi stimoli, anche esterni.

Graphical presentation of PAMAM dendrimers from core to generation G=7 showing the linear increase in diameter and exponential growth of the number of surface groups (Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 2106– 2129). . Core G=0 G=1 G=2 2.0 nm G=3 3.1 nm G=4 4.0 nm G=5 5.3 nm G=6 6.7 nm G=7 8.0 nm

Caricamento dei farmaci: : I farmaci possono essere incorporati nella architettura dendritica per intrappolamento fisico (complessazione) o sfruttando interazioni elettrostatiche, legami idrogeno ed interazioni idrofobiche. Il farmaco può interagire anche con la superficie del dendrimero (interazione covalente ed elettrostatica). Importanti nel caricamento saranno: i tipi di molecole/monomeri utilizzati per formare le diramazioni, la natura dei legami nella formazione del dendrimero (flessibili o rigidi) e i gruppi che definiscono la superficie. Sulfamethoxazole--- PAMAM -----Complexation -----Anti-bacterial Prulifloxacin--- PAMAM--- Complexation--- Anti-bacterial Nadifloxacin---- PAMAM---- Complexation---- Anti-bacterial Sulfadiazine--- PAMAM---- Complexation---- Anti-toxoplasmic Camptothecins ----Polyester dendrimer----Complexation ----Anti-cancer Pilocarpine nitrate ---PAMAM--- Complexation--- Miotic Tropicamide--- PAMAM--- Complexation--- Mydriatic Ibuprofen--- PAMAM--- Conjugation---- Anti-inflammatory Paclitaxel--- PAMAM--- Conjugation--- Anti-cancer Methotrexate--- PAMAM--- Conjugation--- Anti-cancer Doxorubicin--- Polyester dendrimer--- Conjugation--- Anti-cancer Doxorubicin--- Bow-tie dendrimer ----Conjugation--- Anti-cancer Cisplatin--- PAMAM--- Conjugation--- Anti-cancer Methotrexate----- FolateePAMAM--- Conjugation--- Anti-cancer Methotrexate---- Folatee PAMAM---- Conjugation---- Anti-cancer Tanti Anti-infiammatori non steroidei (sfruttando interazione gruppo carbossilico- dendrimero cationico I dendrimeri possono migliorare la solubilità e la biodisponibilità di farmaci nonché facilitare l’interazione con il target e l’ingresso nella cellula attraverso le membrane cellulari (dendrimeri peghilati e direzionati). Utilizzati per somministrazione IV, IM, transdermica ed orale.