Il percorso diagnostico in allergologia Diagnosi Sintomo 2

Il percorso diagnostico in allergologia Diagnosi Sintomo Il percorso diagnostico in allergologia 3

L’Iter diagnostico si fonda su: Anamnesi; Esame obiettivo; Indagini allergologiche

Anamnesi di individuare circa il 60 % dei pazienti allergici ; Una anamnesi corretta permette da sola : di individuare circa il 60 % dei pazienti allergici ; ha una specificità che sfiora il 95% ; consente di individuare la presenza di comorbidità 5

Esame Obiettivo: Non presenta caratteristiche peculiari, Può essere negativo per la caratteristica accessionalità delle sindromi allergiche (utile esaminare il paziente in fase acuta e in fase intervallare, per confrontare i reperti osservati);

Indagini Allergologiche : Test in vivo Prick test Intradermoreazioni Patch test Test di provocazione Test in vitro Dosaggio IgE sieriche Dosaggio mediatori

Principi diagnostici delle malattie IgE-mediate Cute Test Cutanei Dosaggio delle IgE specifiche nel siero Sangue Rilascio istamina Attivazione basofili Challenge specifico nasale, bronchiale, congiuntivale, orale Conta Eosinofili Mucosa

Indagini allergologiche in vivo Prick test alimenti Prick test Patch test Test intradermico TPO

Prick test e allergia respiratoria Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi Prick & Storia Clinica Controversi

Prick test e allergia alimentare Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi Prick & Storia Clinica Controversi TPO

TEST IN VITRO Determinazione IgE totali e specifiche verso estratti e verso singole moleole Determinazione di anticorpi non-IgE verso allergeni Dosaggio di mediatori chimici flogogeni Dosaggio di immunocomplessi Dosaggio di frazioni complementari Eosinofili su secreto nasale

Determinazione delle IgE IgE Totali IgE Specifiche Le IgE totali costituiscono lo 0,004% di tutte le immunoglobuline.

Dosaggio delle IgEs IgE Specifiche verso estratti IgE Specifiche verso singole molecole

TERMINOLOGIA Estratto allergenico Allergene Isoallergene Epitopo Fonte allergenica Estratto allergenico Allergene Isoallergene Epitopo

FONTE ALLERGENICA Indica il contenitore materiale degli allergeni, ad es. : la parietaria, l’uovo, sono fonti allergeniche, non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento.

Gli estratti allergenici comunemente impiegati per la diagnostica in vivo (Ptick test) e in vitro (RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche (polline di graminacee,parietaria,uovo ecc.).

Caratteristiche degli Estatti Allergenici: Gli Estratti Allergenici Grezzi contengono: gli allergeni responsabili della sensibilizzazione, altre sostanze e proteine L’Estratto Antigenico viene sottoposto a processo di tipizzazione degli allergeni facendolo reagire con il siero di pazienti contenenti le IgE specifiche. il Materiale Grezzo viene sottoposto a processo estrattivo della componente proteica, Ciascun soggetto allergico possiede infatti un proprio caratteristico Assetto Allergenico per la presenza di IgE specifiche rivolte verso l’uno o l’altro componente allergenico dell’estratto. La Componente Proteica viene trattata per individuare le sostanze con potere antigenico (mappa antigenica dell’ estratto),non tutte fornite di potere allergenico

Gli allergeni sono proteine, glicoproteine o apteni coniugati a carrier, con peso molecolare tra 5 e 150 kDa, e punto isoelettrico compreso tra 2-10

ISOALLERGENI Indicano forme molecolari multiple dello stesso allergene proveniente dallo stesso organismo con un’estesa, ma non obbligatoria, cross-reattività. Hanno in genere un peso molecolare molto simile, la stessa struttura terziaria e la stessa funzione biologica e hanno almeno il 67% d’identità nella sequenza aminoacidica. Ad esempio di Bet v 1 si conoscono 31 isoallergeni con identità di sequenza tra il 73 e il 98%.

Isoallergeni Xxx y1.01 Xxx y1

Gli Epitopi possono essere lineari o conformazionali Gli Epitopi sono la porzione di allergene effettivamente riconosciuta e legata da un anticorpo specifico Ciascun allergene può presentare un numero elevato di epitopi pertanto ad es. non esistono IgE specifiche per latte (fonte allergenica) o per caseina (allergene del latte) ma IgE specifiche dirette verso gli epitopi della caseina. Gli Epitopi possono essere lineari o conformazionali

EPITOPO Lineare Epitopi “lineari” (aminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla struttura primaria dell’allergene) solitamente termo- e gastro-resistenti

EPITOPO Conformazionale Epitopi “conformazionali” (aminoacidi non in sequenza, non contigui, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della catena proteica possono diventare contigui, la loro formazione dipende quindi dalla struttura tridimensionale dell’allergene) solitamente termo- e gastro- labili

Effetto della cottura e della digestione sulle proteine alimentari 1 E Processing G 1 G G E G 2 2 Sampson & Cooke. J Immunol 1997; 159:2026-2032. 25

CLASSIFICAZIONE DELLE MOLECOLE ALLERGENICHE Le molecole allergeniche si possono ulteriormente classificare in: “GENUINE”, vere marcatrici di una determinata fonte (es. Ole e 1 è la proteina marcatrice dell’allergia al polline dell’olivo e delle altre Oleaceae) “PANALLERGENI”, proteine condivise da fonti allergeniche anche tassonomicamente tra loro non correlate, responsabili di apparenti polisensibilizzazioni ai test eseguiti con estratti

Dalla Fonte allergenica alle molecole Genuine Panallergeni From an allergen source the allergen components can be separated and purified, or produced recombinantly, and sensitization to the components can then be measured individually in separate tests. This helps to pin-point on an exact molecular level, what component the patient is sensitized to. This refined IgE profile provides the basis for an improved diagnosis of the allergy. 27

IgE Specifiche vs estratti Dosaggio delle IgEs IgE Specifiche vs estratti RAST

Dosaggio delle IgEs Si può eseguire, in casi di dubbi, dopo aver effettuato i prick test, per ottenere conferma diagnostica Possono essere eseguite, al posto dei test cutanei, quando questi risultino poco affidabili per:    iporeattività cutanea legata a: - età (primi anni di vita, età avanzata) - farmaci (anti h-1, steroidi, ecc.) - precedenti reazioni cutanee intensamente positive alterata reattività cutanea (ipo o iperreattività) legata a: - malattia allergica in fase acuta e grave -  affezioni cutanee estese -. dermografismo

Il Dosaggio delle IgE Specifiche va attentamente e criticamente valutato Il livello di IgE specifiche non è sempre correlato con la gravità della sindrome clinica Il dosaggio di IgE specifiche ha sensibilità e specificità inferiori rispetto ai test cutanei la positività delle IgE specifiche può non rivestire significato eziologico nei confronti della malattia in atto (es. Cross-reattività con alimenti vegetali, che si riscontra spesso nei pollinosici, senza che vi sia alcuna manifestazione clinica dopo ingestione di quegli alimenti).

Ricerca delle IgEs IgE Specifiche verso singole molecole CRD: Component Resolved Diagnosis

Diagnosi Allergologica in vivo tradizionale Con estratto di Pleum pratense Prick test con estratto di Phleum

Diagnosi Allergologica in vitro tradizionale Con estratto di Phleum pratense Questa diapositiva mostra 9 pazienti con i relativi dosaggi di IgE specifiche fatti con l’estratto intero, cioè con la metodologia tradizionale. Se prendiamo come esempio il paziente 1 e il paziente 8, questi sembrerebbero avere una situazione abbastanza simile per quanto riguarda il loro dato di laboratorio

Allergologia Molecolare Se attraverso l’utilizzo di quella che viene definita diagnostica molecolare andiamo a dettagliare il dato di laboratorio che abbiamo precedentemente osservato, vediamo che i 2 pazienti (1 e 8), hanno dei diversi componenti qui rappresentati dalle barrette di diverso colore. Se consideriamo che ogni barretta ha una funzione biologica diversa associata ad un significato clinico, riusciamo immediatamente a capire quale è l’enorme vantaggio dell’utilizzo della diagnostica molecolare

Phleum: proteine e allergeni Immunoblotting di 12 paz. allergici al Phleum pratense Pattern delle proteine e immunoblotting del siero di pazienti allergici Estazione In questa diapositiva è riportato un immunoblotting di 12 pazienti sensibilizzati al Phleum. Come è possibile vedere ogni paziente ha un profilo di IgE specifiche verso il Phleum ben preciso e unico.

Diagnosi Allergologica in vivo tradizionale Con estratto di Phleum pratense Prick test con estratto di Phleum Phl p1 + - Phl p12 + - Phl p 7 + - Phl p5 + -

Phleum pratense: proteine e allergeni La fonte allergenica… Picture 1: An allergenic source Picture 2 …..contains thousands of molecules

…contiene milioni di molecole…. …di cui solo alcune hanno proprietà allergeniche Picture 3:….. of which only a few are allergenic and may cause allergic diseases. An allergenic molecule or component is a single molecule recognized by allergen-specific antibodies

Che cosa è un allergene ricombinante? Un allergene ricombinante è molecola allergenica prodotta con tecniche di biotecnologia originariamente identificata da un estratto allergenico. La maggior parte dei ricombinanti allergenici esistenti vengono espressi in Escherichia coli e sono normalmente confrontabili con il loro modello naturale(proteina) per quanto riguarda le caratteristiche strutturali e le proprietà immunologiche. Caratteristiche Gli allergeni ricombinanti vengono prodotti senza che le proteine subiscano variazioni genetiche, biologiche o di lotto. Questo assicura l’ottenimento di allergeni di qualità costante ed elevata standardizzazione

IUIS – Nomenclatura WHO Phl p 1 .01 Genere Specie Cronologia Isoallergeni IDENTICHE FUNZIONI BIOLOGICHE PESO MOLECOLARE SIMILE >67% IDENTITA’ DELLA SEQUENZA AA.

Molecole Allergeniche: principali applicazioni 1. Miglioramento nel profilo diagnostico 2. Maggiori informazioni sulle poli-sensibilizzazioni (distinzione tra co-sensibilizzazione e co-riconoscimento) 3. Valutazione della potenziale gravità di una reazione clinica (alcune molecole allergeniche possono essere ”più pericolose” di altre) 4. Ruolo decisionale nell’ambito della ITS 5. Monitoraggio della risposta immunologica durante il trattamento … Lidholm J et al. Component-resolved diagnostics in food allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6:234-40

Polisensibilizzazione Cosensibilizzazione o Cross Reattività

Polisensibilizzazione CO-SENSIBILIZZAZIONE: presenza di IgE dirette verso epitopi distinti e unici presenti in fonti allergeniche diverse (molecole allergeniche genuine) CO-RICONOSCIMENTO (cross-reattività): presenza di IgE verso molecole omologhe presenti in fonti allergeniche diverse (panallergeni) Asero R, 2010, mod. 43

Polisensibilizzazione I “panallergeni” inalanti sono : Profiline CBP (Calcium binding protein o Polcalcine) Asero R, 2010, mod. 44

Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Phl p7 Phl p12 Pollini, alberi, erbe, graminacee CBP PROFILINA Genuine Le Calcium binding Protein hanno 2 siti di legame per il calcio. Sono state identificate nei pollini di numerose piante ( alberi, graminacee, erbe ). I pazienti che producono IgE verso CBP sono pazienti già allergici o a rischio di sviluppo di sintomi allergici in seguito a contatto con pollini. NON sono implicate in allergia piante – alimenti derivati. La germinazione pollinica avviene in presenza di ioni calcio ed è sotto controllo di una classe di proteine in grado di legare ioni calcio ca2+ che si trovano solo nel polline maturo

La Diagnostica Molecolare nell’Allergia respiratoria

Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Genuine Le Calcium binding Protein hanno 2 siti di legame per il calcio. Sono state identificate nei pollini di numerose piante ( alberi, graminacee, erbe ). I pazienti che producono IgE verso CBP sono pazienti già allergici o a rischio di sviluppo di sintomi allergici in seguito a contatto con pollini. NON sono implicate in allergia piante – alimenti derivati. La germinazione pollinica avviene in presenza di ioni calcio ed è sotto controllo di una classe di proteine in grado di legare ioni calcio ca2+ che si trovano solo nel polline maturo

Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Phl p12 PROFILINA Genuine Le Calcium binding Protein hanno 2 siti di legame per il calcio. Sono state identificate nei pollini di numerose piante ( alberi, graminacee, erbe ). I pazienti che producono IgE verso CBP sono pazienti già allergici o a rischio di sviluppo di sintomi allergici in seguito a contatto con pollini. NON sono implicate in allergia piante – alimenti derivati. La germinazione pollinica avviene in presenza di ioni calcio ed è sotto controllo di una classe di proteine in grado di legare ioni calcio ca2+ che si trovano solo nel polline maturo

Allergia Molecolare - Graminacee Phleum pratense 90 % 85 % Phl p1, Phl p5 Phl p7 Phl p12 Pollini, alberi, erbe, CBP PROFILINA Genuine Le Calcium binding Protein hanno 2 siti di legame per il calcio. Sono state identificate nei pollini di numerose piante ( alberi, graminacee, erbe ). I pazienti che producono IgE verso CBP sono pazienti già allergici o a rischio di sviluppo di sintomi allergici in seguito a contatto con pollini. NON sono implicate in allergia piante – alimenti derivati. La germinazione pollinica avviene in presenza di ioni calcio ed è sotto controllo di una classe di proteine in grado di legare ioni calcio ca2+ che si trovano solo nel polline maturo

Allergia Molecolare - Parietaria 83 % Par j 2 Par j 3 PROFILINA Genuine Par j2 è riscontrabile nell’83% della popolazione mediterranea allergica alla parietaria. Nella maggioranza dei casi gli allergici alla parietaria sono monosensibili Par j3 è una profilina NON molto potente nei confronti delle altre specie Il dosaggio della Par j2 é particolarmente utile nelle aree ad elevata concentrazione di graminaceae, compositae e fagales, dove la sensibilizzazione ai panallergeni (profiline e CBP) può determinare risultati falsamente positivi alla parietaria utilizzando la diagnostica per estratti. Pazienti monosensibili alla parietaria possono avere OAS dopo ingestione di pistacchi (Liccardi, D’Amato). Par j 4 Pollini, alberi, erbe, CBP

Allergia Molecolare - Olivo Olivo, (frassino, ligustro,forsitia) Ole e 1 < 30 % Ole e 3, Ole e 8 CBP Genuine Ole e 1 rappresenta il marker di sensibilizzazione al polline di olivo e al polline di piante appartenenti alla famiglia delle oleacee. Ole e 1 cross reagisce con gli allergeni maggiori di frassino, ligustro, lillà Meno del 30% di soggetti sono monosensibili all’olivo Ole e 2 PROFILINA

Allergia Molercolare – Betulla Betulla (fagales) 90 – 98 % Bet v 1 Genuine Più del 95% dei pazienti allergici al polline di betulla (e fagales) sono sensibilizzati all’ allergene maggiore che é il Bet v1 e più del 60% é sensibilizzato esclusivamente a Betv1.

Allergia Molecolare - Betulla Birch (fagales) 10 – 20 % 90 – 98 % Genuine PROFILINA Bet v 1 Bet v 2 Bet v 4 Polleni, alberi, graminacee, erbe CBP Pollini, alimenti mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia, pomodoro, ontano, nocciolo, carpino Alberi, graminacee, erbe, frutta, vegetali, frutta con guscio, spezie, latice

Allergia Molecolare come procedere in pratica A) IDENTIFICAZIONE DELLE FONTI ALLERGENICHE PRIMARIE Storia clinica (la sensibilizzazione esclusiva ad allergeni cross-reagenti è spesso clinicamente silente), SPT, IgE specifiche estratto IgE specifiche per gli allergeni genuini specifici (Phl p 1/5; Amb a 1; Bet v 1; Art v 1; Par j 2; Ole e 1; Fel d 1; Alt a 1) B) IDENTIFICAZIONE REATTIVITA’ A PANALLERGENI IgE specifiche per panallergeni (Phl p 7; Bet v 2; Der p 10) SCELTA DELLA TERAPIA IDONEA

AM il razionale: Chi, Perchè e Quale vantaggio Chi testare? Perchè testare con AM? Quale vantaggio l’AM comporta al clinico? Pazienti con estratto allergenico completo positivo Pazienti poli-sensibili (inalanti, alimenti) Pazienti con pattern e sintomi respiratori non chiari Fare una diagnosi differenziale Definire il reale profilo di sensibilizzazione del paziente Migliore gestione del paziente Definizione della ITS (o altra terapia) Supporto nell’indicazione di eliminazione dell’allergene Suggerimenti per le reazioni di cross-reattività 55 55

CRD e ITS

Selezione dei pazienti da avviare alla ITS Anamnesi Esame Obiettivo SPT o dosaggio IgEs basato sugli estratti Mugwort Birch Timothy

Si tratta di tre sensibilizzazioni genuine? Mugwort Birch Timothy 59

Profilins and polcalcins may cause positive tests ..o di cross-reattività? Mugwort Birch Timothy Profilins and polcalcins may cause positive tests

La risposta è data dalla CRD Mugwort Birch Timothy Genuine sensitization to timothy only

Componenti genuine Phl p 1 Phl p 5 Indicazione per ITS Art v 1 Bet v 1

Componenti cross-reative Profilin Polcalcin Phl p 1 Phl p 5 Phl p 12 Phl p 7 Art v 1 Art v 4 Art v 5 Bet v 1 Bet v 2 Bet v 4 If only cross-reactive markes are identified further investigation is needed

Allergia Molecolare: come procedere in pratica Bianchi A, RIAP febbraio 2011;12-19

La Diagnostica Molecolare nell’Allergia Alimentare L’ausilio della diagnostica molecolare nell’allergia alimentare ha portato un grande aiuto nella formulazione della diagnosi e quindi nella gestione del paziente soprattutto permettendo la comprensione di quelle frequenti situazioni di positività ad alimenti estremamente allargate

Polisensibilizzazione I “panallergeni“ alimentari sono : Profiline (Bet v2 omologhe) PR10 (Bet v1 omologhe) LTP (Lipid Transfer Protein) SSD (Seed Storage Protein) CCD (Cross-reactive Carbohydrate Determinants) Asero R, 2010, mod. 66

Risk assessment The stability of proteins differs between the different protein families, which forms the basis for making risk assessment of the clinical symptoms elicited by sensitization to them. For example, storage proteins that are specific marker allergens in legumes, seeds and nuts are very stable proteins, while profilins, which are labile proteins. Ther, by knowing whether the component is stable or labile, the risk for severe reactions may be predicted.

Stabilità delle proteine Proteine Labili Reazioni locali Proteine Stabili Reazioni sistemiche Labile proteins that are easily broken down by processing, cooking or by enzymes in the saliva or gut will mainly give rise to local reactions, such as Oral Allergy Syndrome, (OAS). Stable proteins on the other hand will reach the circulation in a more or less intact form and therefore potentially give rise to systemic reactions. However, the ingested or inhaled dose of allergen is of utmost importance, and may tip the balance of this rather simplified rule. Thus, even rather labile proteins may potentially give rise to systemic reactions if the quantities are large enough.

Allergia Molecolare – PR -10 Caratteristiche Estremamente labili, facilmente distrutte dal calore, dall’ossidazione, dai processi di estrazione e dalla digestione pepsinica reazioni OAS I pazienti allergici a proteine Bet v 1 omologhe riportano frequentemente una buona tolleranza per gli alimenti cotti e per i succhi di frutta commerciali Betulla (fagales) Bet v 1 Capostipite della famiglia delle PR-10 è la proteina Bet v1, molecola che indica una sensibilizzazione primaria alla betulla. Molecole con una elevata omologia strutturale a Bet v1 sono presenti sia in altre specie arboree appartenenti alla famiglia delle Fagales come il nocciolo, ontano, carpino, ecc., ma anche in certi frutti appartenenti alla famiglia delle Rosacee come la mela (Mal d 1), l’albicocca (Pru ar 1), la pera (Pyr c1) ecc, e in alcuni vegetali come la carota (Dau c1), la soia (Gly m4), il sedano (Api g1) ecc.(1) mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia, pomodoro, ontano, nocciolo, carpino

Lipid Transfer Protein Allergeni Pesca (Pru p 3), mela (Mal d 3), albicocca (Pru ar 3), ciliegia (Pru av 3), prugna (Pru d 3), nocciola (Cor a 8), castagna (Cas s 8), mais (Zea m 14), asparago (Aspa o 1), orzo ( Hor v ), uva (Vit v 1), lattuga (Lac s 1), arachide (Ara h 9 ), senape Caratteristiche Presenti nella buccia delle Rosacee Resistenza alla pepsina e al calore Reazioni sistemiche Pazienti allergici alle LTP riportano frequentemente una buona tolleranza alla frutta sbucciata Essenzialmente presenti nel sud Europa (Italia e Spagna)

Famiglia delle Rosaceae Pru ar 1 Pru ar 3 Pru ar 4 Mal d 1 Mal d 3 Mal d 4 Pru d 1 Pru d 3 Pru d 4 Pyr c 1 Pyr c 3 Pyr c 4 Pru av 1 Pru av 3 Pru av 4 Pru p 1 Pru p 3 Pru p 4 Le proteine appartenenti alla famiglia delle LTP sono state inizialmente identificate soprattutto nella buccia delle rosacee. Successivamente si sono ritrovate anche in specie botaniche non correlate come ad esempio grano, pomodoro, nocciola, ecc. Al contrario delle PR-10 sono molto stabili al calore e alla digestione e per questo motivo risultano responsabili di reazioni sistemiche. La struttura delle LTP è stabilizzata da 4 ponti disolfuro I pazienti allergici alle LTP possono tollerare la frutta sbucciata (no prugna e albicocca) L’LTP è presente inalterata anche nei succhi di frutta e nelle marmellate.. Dopo la digestione il 38% delle LTP resta immodificata. LTP proteine vegetali di trasferimento dei lipidi, hanno la capacità di trasferire i fosfolipidi dei liposomi ai mitocondri Hanno una potente attività antibatterica e antifungina Somiglianza di queste componenti tra differenti frutti con nocciolo

Pru p1 Pru p3 Pru p4

LTP - Frutta e noci Pru p 3 Cor a 8 Rosaceae Noce Nocciola Mais Pera Pesca Ciliegia Albicocca Mandorla Zucca Noce Nocciola Mais Semi di sesamo Semi di girasole Birra (LTP dell’orzo, stabilizzante per fermentazione) Uva Arachidi Senape Pru p 3 Cor a 8 Le LTP sono anche nel pomodoro e si ritrovano inalterate nella salsa perché sebbene siano pelati esistono altre isoforme (3) nella polpa e nei semi Pravettoni.

Esiste solo una LTP? Pru p 3 Par j 2 Cor a 8 Non basta essere sensibilizzato all’LTP per avere anticorpi contro TUTTE le LTP!!!! Pru p 3 Par j 2 Cor a 8 74

Omologia tra LTP Plant nsLTP as food and pollen allergens Saledo G.et al Clin Exp Allergy 2004,34 75

Allergia a proteine di deposito 2S Albumine Arachide (Ara h 2, 6, 7), senape, noce brasiliana (Ber e 1), noce (Jug r 1), semi di ricino (Ric c 1, 3), semi di sesamo (Ses i 1, 2), anacardio (Ana o 3), semi di girasole Caratteristiche Allergeni estremamente stabili Sensibilizzazione sia per via gastrointestinale che respiratoria Resistenza alla pepsina e al calore Spesso associate a reazioni sistemiche Viciline Arachide (Ara h 1),lenticchia (len c 1), nocciola (Cor a 11), noce (Jug r 2), semi di sesamo (Ses i 3), anacardio (Ana o 1) Legumine Arachide (Ara h 3), noce (Jug r 4), anacardio (Ana o 2), nocciola (Cor a 9)