Cromatografia per Scambio Ionico Nella cromatografia per scambio ionico, la ritenzione si basa sull’attrazione tra gli ioni del soluto e i siti carichi legati alla fase stazionaria. La fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, ossia un supporto organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (ad esempio –SO3-, -COO-, -NR3+). I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere scambiati con gli ioni presenti nella fase mobile. Il meccanismo di separazione è basato perciò sulla diversa affinità che i diversi soluti (ionici) presentano nei confronti dei gruppi attivi della resina.

In generale le resine a scambio ionico e complessanti sono costituite da un reticolo irregolare tridimensionale di catene di natura organica unite tra loro da legami incrociati. Su questa matrice sono fissati dei raggruppamenti ionici (quali –SO3-, -COO-, -NR3+) in grado di interagire con uno ione metallico o per semplice scambio ionico o mediante formazione di legami di coordinazione (resine complessanti o chelanti). solitamente uno scheletro polistirenico ottenuto per copolimerizzazione dello stirene con il divinilbenzene. Il contenuto di divinilbenzene può variare dall’ 1 al 16% e determina il grado di reticolazione (cross-linking). Lo scambiatore si dice cationico quando contiene delle cariche negative e i cationi sono attratti elettrostaticamente da questi siti di carica opposta. Lo scambiatore si dice anionico quando contiene dei gruppi carichi positivamente in grado cioè di legare degli ioni di carica negativa. Gli anelli benzenici possono venire modificati per produrre una resina a scambio cationico contente gruppi solfonato (-SO3-) oppure una resina anionica contenente gruppi ammonici (-NR3+). Se al posto dello stirene si usa acido metacrilico si ottiene una resina con gruppi attivi carbossilici e scheletro acrilico divinilbenzenico (-COO-).

Ampio intervallo di pH di utilizzo Tipi di Resine Ampio intervallo di pH di utilizzo Cationico Anionico Forte -SO3- H+ -N+(CH3)3 OH- Debole -COO- H+ -N+H3 OH- La comune definizione delle resine ioniche è fatte sulla base della acidità del loro gruppo attivo Ridotto intervallo di pH di utilizzo

Il grado di reticolazione nelle resine a scambio ionico è variabile ed è scelto in funzione delle caratteristiche che deve presentare lo scambiatore. Resine con alto grado di reticolazione sono rigide e poco porose, lente nel raggiungere l’equilibrio, anche se la selettività e la capacità sono maggiori, rispetto alle resine con basso grado di reticolazione (dette anche macroporose) sono più veloci ad equilibrarsi, ma che si rigonfiano d’acqua. L’affinità maggiore per la fase resina è per ioni: a carica elevata, a piccolo raggio di idratazione, molto polarizzabili (polarizzabilità è capacità della nuvola elettronica di uno ione a venire deformata da cariche vicine e a formare un dipolo).

Diffusione molto veloce ma capacità ridotta I difetti dei polimeri PS/DVB sono: Microporosità della matrice con conseguente lenta diffusione dell’analita nel loro interno Compressibilità Tendenza al rigonfiamento al cambio di eluente Attualmente si utilizzano: Granuli Pellicolari, particelle di vetro non poroso (o polimero) ricoperte di un sottile strato di scambiatore Microparticelle di Silice porosa ricoperte con una sottile pellicola di scambiatore, più economiche Diffusione molto veloce ma capacità ridotta

Equilibri di Scambio Ionico In generale le specie che presentano più cariche tenderanno a legarsi più fortemente alla resina È necessario l’impiego di uno ione competitore perché gli analiti vengano rilasciati: ELUENTE

Un Tipico Esperimento

Cromatografia Ionica È la variante ad alta pressione (prestazioni) della cromatografia per scambio ionico Serve per separare e quantificare ioni, in particolare inorganici, utilizzando resine a scambio ionico

Rivelatore a Conducibilità Il cromatografo ionico è sostanzialmente un HPLC ed è composto da: Riserva di eluente Pompa tipo HPLC Soppressore Integratore Valvola Iniezione Colonna Rivelatore a Conducibilità

Colonne Forti Deboli Sono il cuore dello strumento. La separazione avviene per una serie di equilibri di scambio tra fase stazionaria e fase mobile (eluente) Gli ioni con carica netta più elevata (al pH dell’eluente) vengono trattenuti più fortemente A parità di carica vi è un ordine di selettività che dipende dal tipo di fase stazionaria (dipende dalle costanti di scambio) Forti Deboli

Eluente La fase eluente deve contenere elettroliti forti, composti ionici completamente dissociati, in grado di competere con gli analiti nello scambio con la resina. Gli analiti vengono eluiti più velocemente quanto più è alta la concentrazione di competitori. Può contenere solventi organici (CH3CN, MeOH, ecc.) per evitare l’adsorbimento per interazione idrofobica su resina o gruppi funzionali di analiti organici Se rimane costante durante tutta l’analisi -> Eluizione Isocratica Se cambia di composizione durante l’analisi -> Gradiente di Eluizione Forza Ionica pH Concentrazione dei costituenti Il gradiente si può comporre: sotto pressione con una pompa per ogni componente (più riproducibile ma strumentazione più costosa) non sotto pressione con l’ausilio di un miscelatore posto prima della pompa

Come è possibile ovviare al problema? Rivelatore Dato che si determinano ioni, il rivelatore universalmente utilizzato è costituito da una piccola cella conduttimetrica. Applicando una piccola ddp tra i due elettrodi, fluisce una corrente proporzionale alla conducibilità dell’eluente + analita. Problema: poiché i rivelatori a conducibilità rispondono a tutti gli ioni e l’eluente è costituito da una soluzione elettrolitica concentrata, il suo segnale coprirebbe quello degli analiti. Come è possibile ovviare al problema?

La conducibilità dell’eluente viene eliminata mediante un Soppressore L’unità di soppressione può essere costituita da: Cartucce usa e getta Micromembrana rigenerata controcorrente Micromembrana rigenerata elettroliticamente Il soppressore è uno scambiatore di ioni di segno opposto rispetto agli analiti ed ha lo scopo di diminuire il segnale di fondo dato dagli ioni contenuti nell’eluente.

Integrazione e quantificazione Il rivelatore produce un segnale elettrico analogico (E) che viene digitalizzato e “contato” tramite un integratore (o un interfaccia A/D e un computer). L’area dei picchi del cromatogramma è proporzionale alla concentrazione dell’analita rendendo possibile la quantificazione.

Esempi Separazione di Anioni es. Cl-, NO3- e SO42- La configurazione dello strumento è: colonna con resine ammonio quaternario in forma HCO3-; soppressore in forma H+; rivelatore conduttimetrico. Gli analiti in esame sono dissociati a qualsiasi pH quindi scegliamo come eluente una miscela Na2CO3/NaHCO3 Nella colonna gli anioni si separano ed escono a diversi tempi in forma Na+ (Na+Cl-,…) insieme ad un largo eccesso di Na+HCO3- e Na+2CO32- Tutti gli analiti, trasformati in acidi forti, (H+Cl-,…) danno un segnale mentre l’eluente, ora H2CO3 poco dissociato, non viene rivelato Nel soppressore il catione coordinato (Na+) viene sostituito da H+.

Esempi Separazione di Cationi es. Na+, K+ e NH4+ La configurazione dello strumento è: colonna con resine solfoniche in forma H+; soppressore in forma OH-; rivelatore conduttimetrico. In questo caso l’eluente è HCl Nella colonna i cationi competono con H+ e si separano. Escono coordinati a Cl- (Na+Cl-,…) insieme ad un largo eccesso di H+Cl- Tutti gli analiti, trasformati in idrossidi dissociati, (Na+OH-,…) danno un segnale Nel soppressore l’anione coordinato (Cl-) viene sostituito da OH- e l’eccesso di H+ viene neutralizzato ad H2O.

Esempi Separazione di Acidi Carbossilici AcOH (pKa=4.8) HCOOH (pKa=3.8) Ac Citrico (pKa1=3.1, pKa2=4.7 e pKa3=5.4) Separazione di Acidi Carbossilici L’esperimento sembrerebbe simile a quello dell’analisi degli anioni, ma… In questo caso il rivelatore conduttimetrico non è la scelta migliore perché gli analiti sono acidi deboli e quindi solo in parte dissociati. È più idoneo un rivelatore UV o MS. Anche la scelta del pH del tampone di eluizione è fondamentale, infatti vi sono pH a cui non tutti gli analiti sono dissociati (anioni) e non possono entrare in equilibrio con la resina (ad esempio a pH = 4.0 per l’AcOH). La catena idrofobica dell’Ac Citrico potrebbe dare interazioni tipo WdW con la resina è quindi opportuno introdurre nell’eluente una porzione di CH3CN (o MeOH).