Terapia Genica

Terapia cellulare Allotrapianto: cellule provenienti da un donatore della stessa specie Autotrapianto: cellule provenienti dallo stesso paziente Xenotrapianto: cellule provenienti da animali di specie diverse

Strategie terapeutiche genetico-molecolari Produzione di proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri, lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati). Produzione di anticorpi geneticamente modificati. Produzione di vaccini geneticamente modificati. Terapia genica.

Può essere in vivo o ex vivo Terapia genica Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere in vivo o ex vivo

Vantaggi teorici della terapia genica Correzione radicale dei difetti Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici Vantaggi economici (se è permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

Possibili limitazioni della terapia genica Mancanza di necessità per disponibilità di terapie alternative Mancanza di efficacia Grandi problemi tecnici Costi Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

Attuali problemi tecnici della terapia genica Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) Selettività del sistema di trasferimento Espressione instabile nel tempo Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Problemi etici

Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica? Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili. Gene clonato. Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo. Non richiesta regolazione precisa del gene in questione.

Incremento della dose genica Strategie terapeutiche Incremento della dose genica Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

Correzione mirata della mutazione genica Strategie terapeutiche Correzione mirata della mutazione genica Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo. Efficace anche nel caso di una perdita di funzione.

Inibizione mirata dell’espressione genica Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

Inibizione mirata dell’espressione genica Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica RNAi

Inibizione mirata dell’espressione genica RNA-interference RNAi

Inibizione mirata dell’espressione genica Ribozimi RNAi

Uccisione diretta di cellule patologiche Strategie terapeutiche Uccisione diretta di cellule patologiche

Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario Strategie terapeutiche Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario

Integrazione sito-secifica Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando è entrato? Vettori non virali Vettori virali Integrazione casuale Integrazione sito-secifica

Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Bassi costi di produzione Possibilità di produzione in grandi quantità Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza Se si usano molecole di DNA a doppio filamento anche questi vettori ossono dare mutagenesi inserzionale

Vettori non virali Liposomi

Vettori non virali Endocitosi mediata da recettore

Vettori non virali Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun)

Cosa si può far entrare nelle cellule con vettori non virali Plasmidi Molecole di DNA a doppio filamento lineari Oligonucleotidi DNA Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni chimiche, come i gruppi morfolino) Ribozimi Polipeptidi

Vettori virali In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: Costruzione del genoma ricombinante Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali Raccolta e analisi del virus Trattamento del paziente

caratteristiche principali Vettori virali: caratteristiche principali Retrovirus : possono infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

Retrovirus Enveloped virus RNA genome (2 copies) dsDNA enters into the nucleus and integrates upon mitosis Enters the cell by fusion LTR: viral transcription, polyad., replication, integration

Vettori retrovirali encapsidation cell line ADA plasmid transfection amphotropic encapsidation cell line Gag Pol Env Psi - LTR Gag Pol Env LTR Psi - ecotropic-MoMulv ADA Psi + LTR plasmid transfection

Trial clinico per deficit ADA

Retrovirus Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years treatment. Results published in 1995 Science, Blaese et al

Retrovirus Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy: SCIDXI trial 1998, A. Fisher France Recessive disease X linked Defect in the gc gene, receptor for cytokines => block in T and NK differentiation Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- gc 20x106 cells/Kg

Retrovirus protein expression A. PCR: detection of gc DNA B: RT PCR Detection of gc RNA protein expression Lymphocyte subsets

Retrovirus Genoma di RNA singolo filamento. Possono infettare solo cellule proliferanti Integrazione casuale nel genoma. Difficle produrli in grandi quantità (titolo elevato). Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle stem cells. Poco immunogeni. L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. In assoluto sono vettori più utilizzati per la terapia genica.

X ? Lentivirus (HIV-1) Oncoretrovirus Come infettare le cellule post-mitotiche? Lentivirus (HIV-1) Oncoretrovirus X Nuclear transport dependent Int (MA, Vpr) cPPT-DNA flap Mitosis- dependent ?

Tropismo per linfociti e macrofagi Lentivirus (HIV) Genoma complesso: geni strutturali gag pol env geni regolatori tat rev geni accessori nef vpr vpu vif Tropismo per linfociti e macrofagi Infezione persistente / malattia cronica progressiva

Lentivirus Particelle virali ibride difettive per la replicazionecostituite da: Un set minimo di proteine del core derivate da HIV-1 Il pericapside di un virus non correlato (VSV or MLV) Un genoma contenente: una cassetta di espressione per il transgene affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1 non sono presenti geni virali

Lentivirus: costruzione PROMOTER GA  RRE PROMOTORE SD SA RSV GFP cPPT TRANSGENE Costrutto di trasferimento sequenze attive in cis sequenze attive in trans Provirus HIV-1  GAG PRO POL RRE TAT REV VIF U R ENV NEF SD LTR  GAG PRO POL RRE TAT REV SD polyA CMV Costrutto d’incapsidazione

Vettore lentivirale di ultima generazione Costrutti d’incapsidazione REV polyA RSV SD SA GAG PRO POL RRE CMV Costrutto codificante il pericapside VSV-G SD SA polyA CMV Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) PROMOTER GFP eGFP GA  RRE hPGK SD SA RSV cPPT Wpre

Produzione del vettore Envelope VSV-G SD SA polyA CMV Costrutto di incapsidazione  GAG PRO POL RRE SD polyA SA CMV TAT REV Costrutto di trasferimento PROMOTER eGFP GA  RRE hPGK SD SA RSV cPPT Wpre Trasfezione transiente Cellule 293T Raccolta a 24 e 48 ore Cellule HeLa Titolazione per diluizioni seriali Concentrazione per ultracentrifugazione

Lentivirus GFP expression 3 months after injection

Lentivirus Control ALB promoter CMV promoter

Lentivirus Genoma ad RNA. A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) Scarsissime reazioni immunologiche. Elevata efficienza di trasduzione. Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

Adenovirus

Adenovirus

Adenovirus Late genes (L1-L5) E1 E3 E4 E2 MLP VA IVa2 ITR ITR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 IVa2 E4 (E2F.RE)2 E2 3.6 kb E1 mediated regulation E4 mediated regulation E2 mediated regulation

Vettori adenovirali E1 Late genes (L1-L5) E3 E4 E2 E1 293 cells MLP Late genes (L1-L5) Transgene VA E3 ITR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ITR E4 E2 3.6 kb E1 293 cells ITR

Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di riudrre immunogenicità e aumentare le dimensioni degli inserti.

Adenovirus Genoma di DNA doppio filamento. Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato). Forti reazioni immunologiche.

Integrazione sito-specifica Ciclo vitale degli AAV Fase latente Fase litica Ad Ad Integrazione sito-specifica Replicazione

AAV ITR ITR Rep Cap Integration Packaging Rescue DNA replication Capsid proteins VP1, VP2, VP3 Integration Rescue

AAV, preparazione

AAV, infezione di neuroni

Vettori adeno-associati (AAV) Genoma di DNA singolo filamento. Virus difettivo che richiede per la produzione la contemporanea presenza di un adenovirus. Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Facile produrli in grandi quantità Integrazione sito specifica in un unico locus innocuo (Cr.19), quindi assenza di mutagenesi inserzionale. Espressione stabile nel tempo. Inserti di dimensioni limitate. Efficienza di trasduzione variabile. Poco efficace se purificato bene.

Herpes Simplex Virus (HSV) (ds DNA 152Kb, >70 genes) genome Latency transcripts Latency promoter

Herpes Simplex Virus (HSV) Genoma di DNA doppio filamento molto grande (152 kb) e complesso (>70 geni). Spiccato neurotropismo. Nelle cellule infettate è in forma episomica in uno stato latente. Possibile inserire geni molto grandi. Forti reazioni immunologiche. Presenza di anticorpi contro il virus in un’elevata percentuale di casi.

Potenzialità di combinazione tra terapia genica e purificazione cellule staminali

Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? Il problema principale della terapia cellulare è l’istocompatibilità>rigetto La clonazione permetterebbe di ottenere cellule staminali totipotenti dotate delle stesse caratteristiche antigeniche del paziente, da usare per il trapianto dopo la correzione del difetto.

Perché qualcuno sta pensando seriamente alla clonazione umana? Terapia genica Cellula somatica normale Ovocita Cellule somatiche paziente Cellule totipotenti sane istocompatibili

Terapia genica del cancro: potenziamento della risposta immune

Terapia genica del cancro: sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci TK

Vectors for gene therapy according to www. wiley. co Vectors for gene therapy according to www.wiley.co.uk/genetherapy (june 1999) r e t r o v i r u s l i p o s o m e Adeno a d e n o v i r u s r e t r o p r d c l v a c c i n i a Retro n a k e d D N A Lipo o t h e r s