CHIMICA FARMACEUTICA APPUNTI DI PER BIOTECNOLOGIE Prof. Antonello Mai Dip. Studi Farmaceutici Università “La Sapienza” Roma antonello.mai@uniroma1.it

Scoperta del “LEAD COMPOUND” VALORIZZAZIONE DI INFORMAZIONI BIOLOGICHE: Studio medicine indigene Studio effetti biologici Studio effetti secondari dei farmaci Scoperta fortuita da prodotti industriali SCREENING: Estensivo Random HTS Intermedi e sottoprodotti di sintesi APPROCCIO RAZIONALE: Conoscenza eziologia della malattia Conoscenza target “computer-aided drug design”

SCREENING Estensivo: piccolo numero di molecole su uno studio farmacologico completo Es. FENOTIAZINE BENZODIAZEPINE attività neurolettica scoperta da s. estensivo condotto su antistaminici sedativi sintetizzate per errore e saggiate con s. estensivo dopo 5 anni

Random: gran numero di molecole su target (e attività) mirate Antibiotici Ciclosporina A (polipeptide ciclico screenato come potenziale antibiotico e scoperto ad attività immunosoppressiva) TAXOLO (Paclitaxel) (antitumorale) NEVIRAPINA (anti-AIDS) PIRENZEPINA (antiulcera)

High Throughput Screening (HTS) automatizzato: moltissime molecole su diversi sistemi biologici (soprattutto enzimi) Es. LOVASTATINA (ipolipidemizzante) ASPERLICINA (inibitore CCK) INDOLIL-CARBOSSIAMIDI

Intermedi o sottoprodotti di sintesi: CLORDIAZEPOSSIDO (ansiolitico) CLORDIAZEPOSSIDO

(promettente attività antimicobatterica) Es. ISONIAZIDE (antitubercolare), 1912-1945 SULFATIAZOLI SULFATIADIAZOLI (antibatterici) 2-amminotiadiazoli tiosemicarbazoni (promettente attività antimicobatterica)

VALORIZZAZIONE DI INFORMAZIONE BIOLOGICA piridin-4- carbossialdeide idrazide isonicotinica etile isonicotinato acido isonicotinico 4-metilpiridina VALORIZZAZIONE DI INFORMAZIONE BIOLOGICA Studio di medicine indigene: CHININA, CHINIDINA AC. SALICILICO

Studio degli effetti biologici: Es. 1: trifoglio essiccato ---> emorragia letale allo stomaco DICUMAROLO CUMARINA BENZIL- PENICILLINA Es. 2: Penicillina Pasteur (1878): antagonismo tra 2 ceppi di microorganismi Roux-Duchesne (1897): “Contributo allo studio della competizione vitale tra microorganismi: antagonismo tra muffe e microbi” Fleming (1928) Chain-Florey 1940: da studi sul LISOZIMA, antibiotico antimicrobico che era creduto attivo contro le ulcere duodenali

Studio di effetti secondari dei farmaci Es. 1 MOSTARDA AZOTATA Aggressivo chimico nella Ia Guerra Mondiale in Europa ---> distrugge i globuli bianchi Es. 2 b-BLOCCANTI (coronarodilatatori) ---> (antiipertensivi) analogo ciclico

antiipertensivo ad attività vasodilatatrice periferica diretta: COMPOSTO 1 antiipertensivo ad attività vasodilatatrice periferica diretta: no b-bloccante COMPOSTO 2 100 volte più potente CROMAKALIM 3 volte più potente attivatore canali del K sulla fibrocellula muscol. liscia delle arterie ipopolarizz. ---> vasodilat. Es. 3 a-agonista da usarsi come vasocostrittore nasale o nel sapone da barba: -agonista pre-sinaptico ===> antiipertensivo CLONIDINA

antitubercolare ---> solleva l’umore: IDRAZIDI ANTI-MAO INI (ISONIAZIDE) antitubercolare ---> solleva l’umore: IDRAZIDI ANTI-MAO IPRONIAZIDE (antidepressivo) ISOCARBOSSIAZIDE (antidepresivo)

(antiistaminico) ---> (sedativo) PROMAZINA antiistaminico/sedativo Es. 5 PROMETAZINA (antiistaminico) ---> (sedativo) PROMAZINA antiistaminico/sedativo IMIPRAMINA (antidepressivo triciclico) CLORPROMAZINA (neurolettico)

SULFANILAMIDE SULFAMIDICI antibatterici eff. collater.: diuretici, ipoglicemizzanti TOLBUTAMIDE (ipoglicemizzante) ACETAZOLAMIDE (diuretico)

4. Scoperta fortuita da prodotti industriali Es. 1 Es. 2 2-amminotiazolo 2-mercaptoimidazolo NITROGLICERINA esplosivo vasodilatatore delle coronarie Es. 3 TIAMAZOLO CARBIMAZOLO (antitiroidei) DIETILDITIOURAME (DISULFIRAM) antiossidante nell’industria della gomma disassuefacente dall’alcool

APPROCCIO RAZIONALE Basato sulla conoscenza: delle alterazioni biochimico-metaboliche caratteristiche di determinate condizioni patologiche e responsabili, in taluni casi, della malattia e più frequentemente dei suoi sintomi più fastidiosi; delle caratteristiche strutturali e/o funzionali di determinati target macromolecolari (enzimi, recettori, canali ionici, proteine trasportatrici); della struttura chimica e delle funzioni biologiche dei ligandi fisiologici dei target sopracitati: agonisti, antagonisti, agonisti parziali ed inversi nel caso dei recettori; substrati, prodotti, attivatori ed inibitori nel caso di enzimi. Contributi essenziali da parte di: Biochimica, fisiologia, genetica, biologia molecolare, metodiche chimico-fisiche (N.M.R., E.P.R., spettrometria di massa, raggi X, scattering di neutroni), informatica.

Terapia sintomatica ma razionale del morbo di Parkinson. ESEMPI: Terapia sintomatica ma razionale del morbo di Parkinson. I sintomi compaiono quando il contenuto di DOPAMINA nel corpo striato diventa il 20-40 % dei valori normali. DOPAMINA (mediatore endogeno) 3,4 – DIIDROSSIFENILALANINA (L- DOPA) (precursore fisiologico della dopamina) attraversa BBB non attraversa BBB DOPA-decarbossilasi (DDC)

(barriera emato encefalica) BBB (barriera emato encefalica) SANGUE E TESSUTI PERIFERICI CERVELLO TRATTO GI DDC 1 % L - DOPA DDC MAO DOPAMINA DDC COMT 90% 9 % CARBIDOPA BENSERAZIDE inibitori DOPA-decarbossilasi non attraversano BBB

<------------ ACE ------------> B. Scoperta degli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina. B. Scoperta degli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE). Dettagli biochimici del sistema renina-angiotensina noti dai primi anni ‘60. angiotensinogeno chininogeno renina ---> <--- callicreina angiotensina I (10 AA) (inattiva) bradichinina (9 AA) (potente vasodilatatore) <------------ ACE ------------> angiotensina II (8 AA) (vasocostrittore 40 volte più potente di nor-adrenalina: stimola il rilascio di aldosterone) eptapeptide inattivo

inibitore carbossipeptidasi A TEPROTIDE (9 AA) pyro-Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Ile-Pro-Pro-OH primo inibitore noto di ACE ad attività antiipertensiva (1965) non biodisponibile per via orale ipotesi di design di inibitori ACE ac. benzilsuccinico inibitore carbossipeptidasi A N-succinilprolina (330 mM) 1 (22 mM) 2 (1480 mM) 3 (0.20 mM) CAPTOPRIL (0.023 mM)

C. Scoperta di antagonisti selettivi del recettore istaminergico H2. Antistaminici classici (mepiramina) non antagonizzano la secrezione acida gastrica da IST = nuova sottoclasse recettoriale (Black et al., 1964) sintesi di oltre 200 composti correlati ISTAMINA ligando endogeno agonista puro Na-GUANILISTAMINA 1° lead compound agonista parziale Requisiti per attività antagonista: anello imidazolico catena alchilica n = 2-4 gruppo finale protonabile (funzionalità amidinica) per leg. H bidentato con ossiacido n = 2-4; X = S, NH; Y = SCH3, CH3, NH2 Tutti agonisti parziali

BURIMAMIDE METIAMIDE CIMETIDINA 1° antagonista puro non biodisponibile per os METIAMIDE 10 vv più potente biodisponibile per os tossicità dovuta a residuo di tiourea CIMETIDINA 1° anti-H2 approvato contro l’ulcera peptica (1976)

D. Computer-aided drug design Si utilizza un modello 3D sperimentale o ipotetico del sito di binding del target molecolare sviluppando nuovi ligandi mediante: Ottimizzazione di ligando già noto Ricerca nei database di strutture 3D di composti con caratteristiche stereoelettroniche ottimali per l’interazione - Progettazione “de novo” di ligandi specifici B. PROGETTAZIONE INDIRETTA DI LIGANDO BASATA SU UN MODELLO 3D DEL SITO DI BINDING DEDOTTO DA ALTRI LIGANDI A STRUTTURA 3D NOTA (AGONISTI O ANTAGONISTI) PROGETTAZIONE DIRETTA DI LIGANDO BASATA SU STRUTTURA 3D NOTA DEL SITO DI BINDING STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN LIGAND-BASED DRUG DESIGN

STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN Isolamento e produzione su vasta scala di target (tecnologia: DNA ricombinante) Determinazione della sua struttura 3D attraverso: cristallografia a raggi X tecniche NMR scattering di neutroni Identificazione e caratterizzazione sito di binding sterica (DOCK) elettrostatica (GRID) Determinazione della conformazione di binding di ligando noto (AUTODOCK, MACROMODEL) Ricerca o design di nuovi ligandi Calcolo di energie di affinità (DG) e costanti di inibizione (Ki)

LIGAND-BASED DRUG DESIGN Impossibile isolare e/o produrre il target in quantità adeguate per risoluzione struttura 3D Unici dati disponibili = dati di serie più o meno ampie di agonisti e antagonisti Identificazione del farmacoforo o modello farmacoforico Mappatura del sito di binding, cioè deduzione del modello 3D dello stesso Ricerca e design di nuovi ligandi 3D-QSAR (CoMFA)

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND” Principio di Isosteria Principio di Omologia lineare e ciclica Composti Viniloghi e Benzologhi Semplificazione e Complicazione Molecolare (approcci disgiuntivi e congiuntivi) 5. Distanze intramolecolari 6. Raddoppiamento molecolare (farmaci gemelli)

Principio di Isosteria Concetto base: introdurre nel lead compound modificazioni chimiche tali che, pur variandone alcune caratteristiche strutturali e chimico-fisiche, ne mantengano intatta la capacità di interagire con il target biologico. Nuovo composto = profilo farmacologico complessivo migliore 1918, Langmuir: isosteri due molecole che contengono lo stesso numero e disposizione di elettroni: O2-, F-, Ne, Na+, Mg+2, Al+3 MOLECOLE MONOATOMICHE CO, N2 MOLECOLE BIATOMICHE CO2, N2O MOLECOLE TRIATOMICHE ClO4-, SO4-2, PO4-3 MOLECOLE POLIATOMICHE

gruppi isosteri isoelettronici 1925, Grimm (legge dello spostamento dell’idruro): l’aggiunta di un idrogeno ad un atomo conferisce al’aggregato la proprietà dell’atomo successivo nella tavola periodica: n° elettroni gruppi isosteri isoelettronici 7 N CH 8 O NH CH2 9 F OH NH2 CH3 14 CH=CH N=N C=O 16 CH2-CH2 NH-NH S 36 42 44

1932, Erlemmeyer (ampliamento del concetto di isosteria): Isosteri = atomi, ioni, gruppi funzionali o molecole che presentano la stessa configurazione elettronica ESTERNA O S Se VI GRUPPO (6 elettroni nel guscio più esterno) N P V GRUPPO (5 elettroni nel guscio più esterno) C Si IV GRUPPO (4 elettroni nel guscio più esterno) Inclusi anche gruppi funzionali con marcate analogie chimico-fisiche: Cl, CN, SCN Equivalente di anello: solo in composti ciclici S è isostere di CH=CH

1951, Friedman (da isosteria a bioisosteria): bioisosteri = gruppi o molecole aventi almeno una analogia chimica o fisica, che producono effetti biologici spiccatamente simili Es. 1: entrambi Antiepilettici isosteri e bioisosteri OSSAZOLIDINDIONI IDANTOINE Es. 2: antimetaboliti bioisosteri AC. P-AMINOBENZOICO SULFANILAMIDE

Es. 3: GABA-agonisti: pKa circa = 4 per tutti funzione basica protonabile distanza intercarica = 5Å GABA ISOGUVACINA THIP Es. 4: PROCAINA anestetico locale PROCAINAMIDE antiaritmico isosteri classici non bioisosteri

Omologia lineare e ciclica Serie omologa = insieme di composti che differiscono per una o più unità metileniche (-CH2-) ed hanno differenze qualitative e/o quantitative di attività farmacologica A. OMOLOGIA LINEARE (derivati monoalchilati) R-X → R-CH2-X → R-CH2-CH2-X → … → R-(CH2)n-X Es. 1: CETILPIRIDINIO CLORURO (Cepacol) tensioattivo cationico ad attività antisettica omologhi con n. di metileni <15 sono inattivi come germicidi

Analoghi della NOR-ADRENALINA Es. 2: recett. Eff. ipertensivo Eff. ipotensivo H a ++ - Me a, b Et + n-Prop b iso-Prop n-But iso-But Esempio di inversione di attività farmacologica in serie omologa

B. OMOLOGIA CICLICA (composti ciclopolimetilenici) Es. 1: X (CH2)n X (CH2)n+1 serie omologa di composti ad attività antiipertensiva GUANETIDINA optimum di attività antiipertensiva per n = 7 Es. 2: analoghi dell’ENALAPRILATO (ACE-inibitore) n IC50, nM 19.000 1.700 19 4.8 8.1 ENALAPRILATO

Es. 3: MEPERIDINA analgesico narcotico con attività tossicomanogena ETOEPTAZINA analgesico narcotico privo di attività tossicomanogena Es. 4: TOLAZAMIDE ipoglicemizzante orale GLICICLAMIDE ipoglicemizzante orale esempio di omologazione + isosteria = aza-omologazione

COMPOSTI POLIMETILENICI BIS-AMMONICI C. OMOLOGIA LINEARE 2 (composti polimetilenici bifunzionali a catena aperta) X-(CH2)n-Y X-(CH2)n+1-Y X = o ≠ Y COMPOSTI POLIMETILENICI BIS-AMMONICI (METONI) A partire da n = 1: attività bloccante dei recettori colinergicinicotinici dei gangli del sistema nervoso autonomo (GANGLIOPLEGICA), che raggiunge il massimo per n = 6 (ESAMETONIO BROMURO, utilizzato come agente ipotensivo). Da n = 7 in poi l’attività ganglioplegica diminuisce, per scomparire del tutto negli analoghi superiori, nei quali compare una nuova attività di blocco dei recettori colinergici nicotinici a livello della placca motrice (CURARO- MIMETICA), che raggiunge il suo culmine per n = 10 (DECAMETONIO IODURO, bloccante neuromuscolare utilizzato come succedaneo della d-tubocurarina per indurre rilassamento muscolare nell’anest. chirurgica)

rilass. muscolatura scheletr. DECAMETONIO IODURO curaromimetico rilass. muscolatura scheletr. ESAMETONIO BROMURO ganglioplegico antiipertensivo Vinilogia e benzologia (Principio di Angeli) Due sostituenti X e Y posti in posizione orto o para di un anello benzenico, oppure separati tra loro da catene insature (doppi legami coniugati) si comportano in genere come se fossero direttamente uniti tra loro X-Y → X-CH=CH-Y X-Y →

Es. 1: X = RESERPINA Alcaloidi naturali della Rauwolfia Serpentina ad azione ipotensiva e neurolettica RESCINAMINA Es. 2: vinilogo ad azione più breve perché meno stabile MEPERIDINA (analgesico narcotico) vinilogo della meperidina

sensibilità alla Ach-esterasi vinilogo dell’ACETILCOLINA Es. 3: vinilogo dell’Ach ACETILCOLINA (Ach) composto attività nicotinica attività muscarinica sensibilità alla Ach-esterasi Ach + sensibile vinilogo - insensibile

cicloviniloghi della procainamide PROCAINAMIDE Es. 4: (composti benzologhi) SULFANILAMIDE antibatterico DAPSONE (DDS) antileprotico Es. 5: cicloviniloghi della procainamide PROCAINAMIDE composto attività anestetica locale attività antiaritmica procainamide 1 ciclovinilogo orto 0.17 ciclovinilogo meta 47 ciclovinilogo para 35

Semplificazione e Complicazione molecolare (Approccio disgiuntivo e congiuntivo) A. SEMPLIFICAZIONE MOLECOLARE MORFINA analgesico narcotico inconvenienti ed eff. collaterali: depressione del respiro azione stupefacente dipendenza fisica e psichica benzomorfano 4-fenil- piperidine fenil-alchil- ammine epossimorfinano morfinano

COCAINA anestetico locale stimolante il CNS EUCAINA A anestetico locale PROCAINA anestetico locale

forma conformazionalm. ristretta B. COMPLICAZIONE MOLECOLARE forma conformazionalm. ristretta dei PETT PETT anti-HIV-1 GABA AC. 4-AMMINO- CROTONICO ISOGUVACINA THIP potente GABA agonista

Distanze intramolecolari D-TUBOCURARINA curarizzante naturale DECAMETONIO curarizzante SUSSAMETONIO (SUCCINILCOLINA) curarizzante ESAMETONIO ganglioplegico 14,5 Å

ormone naturale estrogeno ESTRADIOLO ormone naturale estrogeno TRANS-DIETILSTILBESTROLO estrogeno di sintesi CIS-DIETILSTILBESTROLO inattivo 14,5 Å

Raddoppiamento Molecolare (Farmaci Gemelli) ACETILCOLINA (2 molecole) colinergico SUCCINILCOLINA curarommetico (pseudo- raddopiam.) DAPSONE antileprotico SULFANILAMMIDE (2 molecole) antibatterico

max affinità per DNA = n num. pari PENTAMIDINA intercalante il DNA tripanocida BIS-BENZOIMIDAZOLI intercalanti il DNA max affinità per DNA = n num. pari