AN EXAMPLE FROM MORE ADVANCED BIOINFORMATICS

Presentazione sul tema: "AN EXAMPLE FROM MORE ADVANCED BIOINFORMATICS"— Transcript della presentazione:

1 AN EXAMPLE FROM MORE ADVANCED BIOINFORMATICS
Gene expression data analysis

2 VI LEZIONE Introduzione all'analisi di dati d'espressione genica. Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala. Profili e matrici d'espressione. Ricerca di geni co-espressi e di geni differenzialmente espressi.

3 Computational analysis of data by statistical methods
Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala: Basati su ibridazione: Microarray/Chip Basati su conteggio di sequenze: EST sequencing, SAGE, e deep sequencing di librerie di cDNA Deep seq. EST SAGE MICROARRAY CHIP Computational analysis of data by statistical methods

4 ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE
Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme dei geni

5 REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA
Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione Principali tipi di regolazione: Controllo epigenetico Controllo trascrizionale Controllo post-trascrizionale

6 “Large-scale approach”
“One-gene approach” Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Real Time PCR PCR semiquantitativa Ibridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot) Ibridazione in situ “Large-scale approach” Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ? Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Profilo d’espressione del genoma (TRASCRITTOMA)

7 METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA BASATI SUL SEQUENZIAMENTO
Sequenziamento sistematico di ESTs da librerie di cDNA Sequenziamento sistematico con metodi di terza generazione di librerie di cDNA SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

8 Deep seq. EST SEQUENCING mRNA of different genes cDNA LIBRARY

9 ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE
UniGene Human Release Statistics Total sequences in clusters: Total number of clusters sets: 22094 sets contain at least one known gene 94710 sets contain at least one EST 20876 sets contain both genes and ESTs ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE Sample of ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts eg. Rhodopsin: 65 retina ESTs  65 / = 0.503%

10 SAGE Serial Analysis of Gene Expression
SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala per avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997) Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG)

11 SAGE una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti (una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto). le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate. il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente.

12 Esperimenti di Microarray
DUE CANALI Esperimenti di Microarray Permettono l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente

13 MICROARRAY DUE CANALI

14 Microarray a 2 canali

15 Microarray a 2 canali

16 Microarray a 2 canali

17 GeneChip Affymetrix SINGOLO CANALE
Ibridizzazione della sonda marcata Scansione del GeneChip con scanner laser

18 Microarray a 1 canale

19 Microarray a 1 canale

20 Microarray a 1 canale

21 Microarray a 1 canale

22 Microarray a 1 canale

23 Affymetrix Genechips Perfect Match Mismatch 11-20 probe-pairs per gene
5' 3' Sequence Probes Perfect Match Mismatch Target sequences are selected from the 3’ end of the transcript Probes should be unique in genome (unless probesets are intended to cross hybridize) Probes should not hybridize to other sequences in fragmented cDNA Thermodynamic properties of probes 11-20 probe-pairs per gene

24 Espressione differenziale
Analisi immagine Normalizzazione Espressione differenziale Clustering Interpretazione biologica

25 Analisi dell’immagine
MICROARRAY GeneChip Affymetrix SINGOLO CANALE Analisi dell’immagine Identificazione della posizione degli spot Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot Calcolo del background locale

26 MICROARRAY GeneChip Affymetrix SINGOLO CANALE Elaborazione dei dati

27 Deep seq. EST SAGE MICROARRAY CHIP

28 Matrice dei risultati: righe = geni, colonne = condizioni sperimentali
… Cond. m Gene 1 x11 x12 x1m Gene 2 x21 x22 x2m Gene n xn1 xn2 xnm Quali geni sono differenzialmente espressi ? Quali e quanti geni sono co-espressi?

29 Obiettivi dell’analisi saranno…
Identificazione geni differenzialmente espressi Identificazione pattern di espressione comuni Identificazione di geni co-espressi con geni di funzione nota

30 Schema sperimentale “semplice”: Dati d’espressione in colon normale e carcinoma Domanda biologica: Quali geni sono differenzialmente espressi nel confronto ?

31 GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI
Fold Change: un primo criterio puo’ essere quello di identificare i geni la cui espressione nei due gruppi di campioni considerati varia di una certa proporzione (raddoppia, dimezza, …) fold change = 2 Molti falsi positivi I geni poco espressi risultano differenzialmente espressi anche3 con variazioni non significative Selezione basata sui p-values associati a Test T: si applica un test statistico per il confronto delle medie di due campioni a ciascun gene; ogni gene risulta associato ad una probabilità (di essere differenzialmente espresso) Si esegue uno stesso test statistico molte volte, serve una correzione Uso di metodi basati su permutazioni (SAM) e FDR

32 Schema sperimentale piu’ complesso: Dati d’espressione in piu’ condizioni Domanda biologica: Posso identificare gruppi di geni espressi in modo simile ?

33 CLUSTER ANALISI Il CLUSTERING o analisi cluster o analisi di raggruppamento è un insieme di tecniche di analisi multivariata dei dati volte al raggruppamento di elementi omogenei. Un insieme di oggetti grande e disomogeo viene classificato in una serie limitata di gruppi omogeneei, ovvero “vicini” in accordo con una specifica misura di distanza.

34 Standardizzazione dei dati Linking method
CLUSTER ANALISI DUE STEPS: Misura di similarita’ Diverse misure Standardizzazione dei dati Linking method criterio per stabilire i gruppi Metodi gerarchici e non gerarchici

35 I geni sono punti nello spazio:
CLUSTER ANALISI I geni sono punti nello spazio: punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme Si parte dalla matrice dei dati X di dimensione nxp e la si trasforma in una matrice nxn di dissimilarità o di distanze tra le n coppie di osservazioni (vettori di p elementi). Si sceglie poi un algoritmo che definisca le regole su come raggruppare le unità in sottogruppi sulla base delle loro similarità. Lo scopo e’ di identificare un cero numero di gruppi tali che gli elementi appartenenti ad un gruppo siano – in qualche senso – piu’ simili tra loro che non agli elementi appartenenti ad altri gruppi.

36 Correlazione di Pearson
CLUSTER ANALISI Distanza euclidea Correlazione di Pearson

37 1- Data Matrix PROBESET/GENE CD34 Eritroblasti Mieloblasti MKC
Monoblasti Monociti Neutrofili Eosinofili GC00U921857_at -1.0 1.2 1.1 -1.1 -0.2 GC00U922066_at -0.5 -0.9 GC00U990452_at 1.0 0.0 GC00U990575_at 0.1 GC00U990668_at 0.3 -0.3 -1.2 GC00U990680_at -0.8 0.2 GC00U990706_at -0.1 0.4 0.9 GC01M033561_at GC01M035219_at 0.5 GC01M035470_at GC01M035671_at GC01M035737_at -0.4 GC01M035952_at 1.3 GC01M035958_at GC01M036333_at

38 2- Data representation

39 3-Distance and linking method selection

40 Pearson QT clustering Insieme disomogeneo di 40 geni
6 cluster, gruppi omogenei

41 4 - Result