ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

Presentazione sul tema: "ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO"— Transcript della presentazione:

1 ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

2 Definizione CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO
Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita

3 Principi di funzionamento
Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica) Sistema ottico (laser Argon 488nm) Sistema elettronico (software CellQuest)

4 Sistema Fluidico

5 Sistema Ottico

6 Sistema Elettronico

7 Parametri LIGHT SCATTERING (Forward and Side Scatter) FLUORESCENZA
(FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC, ...)

8 Light Scattering Sangue periferico

9 Fluorescenza Plot FITC/PE/Per CP
IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA Plot FITC/PE/Per CP Intensita’ F proporzionale ai siti di legame

10 Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD
Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che: identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo ha una struttura biochimica definita è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

11 Informazioni aggiornate
(

12 Applicazioni determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari valutazione del contenuto cellulare di DNA discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche predisposizione per la separazione cellulare

13 e malattia residua minima
Immunofenotipo Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti in caso di antigenti specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima

14 Marcatori B-lineage TdT CD79a CD19 CD10 CD20 CD22 Cu SmIg

15 Marcatori T-lineage CD7 CD2 CD5 CD3 CD1 CD4 CD8 TdT TCR

16 Marcatori granulocitopoiesi
CD34 CD13 CD33 CD117 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15

17 Marcatori monocitopoiesi
CD34 CD13 CD33 CD14 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15

18 Marcatori eritrocitopoiesi
CD34 CD45 CD33 CD71 CD105 CD36 GPA

19 Gating CD 45 ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

20 Espressione CD45 Linfociti Monociti Granulociti maturi
Cellule immature Granulociti immaturi Eritrociti

21 Scelta degli antigeni e Criteri di Positività
ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B) ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133) Positività?

22

23 ALL-T

24 ALL-T CD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT ,(CD34)

25 ALL-B, common

26 ALL-B, common CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15)

27 ALL-B, B matura

28 CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT
ALL-B, B matura CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT

29 LAP

30 LAP MPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR, CD41, CD56, CD61 (CD2)

31 G+15 dopo terapia con ATRA
LAP G+15 dopo terapia con ATRA ESORDIO:popolazione blastica G+15:popolazione matura

32 LAM

33 Midollo osseo, liquido cefalorachidiano
BM liquor

34 Midollo osseo, sangue periferico, liquido cefalorachidiano
BM PB liquor

35 Neuroblastoma

36 Ciclo cellulare e apoptosi
DATI RICERCA Differenziamento Pession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene Nov 27;22(54): Ciclo cellulare e apoptosi Pession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol Feb;24(2):

37 VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica :
multiparametricità possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula analisi di grandi quantità di cellule riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni grande sensibilità rapidità di analisi possibilità di ulteriori analisi a posteriori

38 Conclusioni La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi emato-oncologica : Identifica la malattia residua minima Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione del midollo Determina la presenza di malattia disseminata (ALL latente, santuari exramidollari)