CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI

Presentazione sul tema: "CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI"— Transcript della presentazione:

1 CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI
CARDIOMIOCITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI “IN GITA A FIRENZE!!!” 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

2 Università degli Studi di Firenze
Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica "Mario Aiazzi Mancini" FACOLTA’ DI MEDICINA 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

3 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

4 IL CUBO 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

5 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

6 CENTRI OSPITATI Centro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (C.I.S.M.)      Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (C.I.M.M.B.A.) Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (Ce.S.A.L.)      30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

7 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

8 LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA CARDIACA
COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A? LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA CARDIACA 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

9 Rimodellamento Elettrofisiologico e Molecolare della cellula e tessuto
cardiaco durante lo sviluppo fisiologico e durante alcune patologie cardiache Studio di farmaci antiaritmici e delle sostanze che modulano la frequenza cardiaca. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

10 QUALI MODELLI? Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di cuore (umano o animale) patologico; Cardiomiociti in vitro: -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di cellule staminali embrionali -cardiomiociti immortalizzati; Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

11 POTENZIALI DI MEMBRANA; POTENZIALI D’AZIONE;
PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO? ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE DATI SU: CORRENTI IONICHE; POTENZIALI DI MEMBRANA; POTENZIALI D’AZIONE; EFFETI DI FARMACI E ALTRE SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

12 10.000 EURO L’iter delle cellule: PRODOTTE IN AUSTRALLIA
DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA) FATTE INVECCHIARE E CARATTERIZZATE A FIRENZE EURO 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

13 Più difficili da conservare.
INVECCHIAMENTO EARLY  15-40: Più facile da mantenere. LATE : Più difficili da conservare. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

14 EARLY: LATE: ICal; Ito IKr; IK1; If  sparisce; 30 aprile 2009
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15 PATCH -CLAMP PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO SECONDO PASSO: DIVISIONE
(ENZIMA, VINCERE ELASTICITA’) TERZO PASSO:PIASTRINE (SOSPESO ENZIMA, VETRO) QUARTO PASSO: SOLUZIONI 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

16 PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA; UNICA.
INTRA (ELETTRODO): FISIOLOGICA; IONI DI SELZIONE; EGTA. PH=7.2; PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA; UNICA. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

17 DIFFERENZIATE EXTRA (PIASTRINA): TYRODE NaCl  140 mM; KCl  5,4 Mm;
MgCl2 1,2 mM; Glucosio; HEPES (Acido); pH=7.3 Inseguito CaCl2 2mM; DIFFERENZIATE 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

18 Set-up: insieme di tutti gli elementi che permettono di fare la misura
microscopio; amplificatore Axon; multi canale; braccio e elettrodi; provette con dentro le soluzioni extra-cellulari; perfusore per fare entrare le soluzioni nei vetrini; Aspiratore (occhio posizionamento); Aspiratore per suzione Rilevatore temperatura. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

19 SEAL Elettrodo lontano Seal=200 MΏ; Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ;
Suzione Seal=50 MΏ; Rottura Seal=80 MΏ; Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ. Il GΏ E’ UN SOGNO!!!!!!! PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…) TENUTA DELL’HOLDER. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

20 PROTOCOLLO PULSE 2 mV I=V/Rseal  Rseal sale  I scende
PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL DIFFICOLTA’: CELLULE PICCOLE E PIATTEINCUBAZIONE; ROTTURA OVERLOAD 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

21 Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana;
POSSO ANCHE CALCOLARE Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana; Time costant Resistenza foro (apertura protocollo) capacità foro; Se c’è del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo). 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

22 STUDIO DELLE CORRENTI E DEI POTENZIALI
Perfondere con la soluzione extra adatta; Applicare un protocollo; Registrare; Fare esperimenti con protocolli e soluzioni extra diverse (perfusione, aspirazione); Ricominciare; 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

23 If 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

24 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

25 ESPERIMENTO ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETA-ADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE) REVERSIBILITA’  LAVAGGIO ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE): CORRENTE DI POTASSIO, POICHE’ VENGONO ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE AUMENTANO LA Gk 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

26 INaCa 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

27 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

28 REGISTRAZIONI 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

29 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

30 THANKS TO ALL THE C3MIGers
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