CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 1 Schema Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti, si possono avere.

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1 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 1 Schema Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

2 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 2 Il “prodotto” della cromatografia con rivelatore in uscita

3 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 3 IL PICCO CROMATOGRAFICO: parametri relativi alla banda singola Tempo di ritenzione (tR) = tempo impiegato da ciascuna sostanza per scorrere attraverso la colonna, misurato a partire dall’istante in cui la miscela viene introdotta nello strumento, fino all’istante in cui si registra il massimo del tracciato Cromatografico Altezza del picco (h) = distanza tra il punto massimo e la linea di base Larghezza alla base del picco (wb) = lunghezza del segmento interpolato all’intersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base Larghezza a metà altezza (wh) = larghezza del picco misurata a metà altezza Tempo morto (tM) = tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria Tempo di ritenzione corretto (t’R) = tempo effettivamente speso da ogni sostanza eluita nelle interazioni chimico-fisiche con la fase stazionaria

4 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 4 ALTRI PARAMETRI BANDA SINGOLA GRANDEZZE VOLUME DI RITENZIONE/ELUIZIONE: V ’ r Volume di fase mobile eluita dal momento dell ’ ingresso al momento dell ’ uscita dalla colonna di una determinata sostanza VOLUME MORTO: V m volume di colonna non occupato dalla fase fissa VOLUME DI RITENZIONE CORRETTO: V ’ r V ’ r= V r - V m VALE: V r= t r xFc V ’ r= t ’ r xFc

5 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 5 posizione La posizione dei picchi sull’asse dei tempi serve: a identificare i componenti del campione ( ogni sostanza ha affinità diverse per FS e FM) area L’area sottesa dai picchi: è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo MISSIONE: SEPARARE CON PICCHI RISOLTI E SIMMETRICI ED IN TEMPI RAGIONEVOLI

6 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 6 INTRODUZIONE PARAMETRI SIGNIFICATIVI

7 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 7 PARAMETRI RELATIVI A COPPIE DI BANDE: agenti sulla velocità di uscita COSTANTE DI DISTRIBUZIONE In ogni istante nel processo cromatografico le sostanze tendono a distribuirsi tra le due fasi in modo specifico. Supponiamo quindi che si raggiunga una situazione di equilibrio dinamico dove: C M C S a cui corrisponde una costante (o anche coefficiente) di distribuzione (K C ) = C S /C M Vd figura 18.11 libro

8 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 8 DA COSA DIPENDE Kc? La costante di distribuzione è una grandezza termodinamica dipende: dalla natura della fase mobile e della fase stazionaria, dalla temperatura di lavoro Se K C è grande: la sostanza è più affine alla fase stazionaria e quindi vi rimarrà più a lungo che nella fase mobile Per le sostanze che non vengono trattenute dalla fase stazionaria si ha K C = 0 in quanto CS = 0. Kc influenza tempi e volumi di ritenzione V R = V M + KcVs Se 2 sostanze hanno Kc simili come si può intervenire?

9 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 9 FATTORE DI RITENZIONE k = nS/nM Che relazione ha con Kc? Considerando la relazione tra numero moli e conc.molare e la definizione di Kc si ricava: k = (VS/VM)x K C Quali fattori lo influenzano? determinato tipo di colonna Il fattore di ritenzione è un parametro che caratterizza il comportamento di una determinata coppia di fasi (mobile e stazionaria) e di un determinato tipo di colonna dipende quindi da: –Granulometria/impaccamento Fs –Temperatura –Affinità analita per le fasi –Non dalla geometria della colonna

10 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 10 Come si ricava? Il fattore di ritenzione può essere ricavato direttamente da due parametri che si ottengono dal cromatogramma: il tempo di ritenzione corretto e il tempo morto. K= t ’ R/tM QUALI SONO I VALORI IDEALI? Quando il fattore di ritenzione è 1, l’analita esce con la fase mobile Fattori di ritenzione elevati (> 20) sono indice di lunghe eluizioni. I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.

11 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 11 SELETTIVITA ’ SELETTIVITA ’ Una separazione cromatografica per essere efficace deve essere selettiva: le sostanze devo uscire in tempi distanti l ’ una dall ’ altra in modo da avere picchi separati La selettività di un sistema cromatografico viene espressa dal cosiddetto fattore di separazione o ritenzione relativa α = t' R2 \t' R1 Dipende dal tipo di interazione delle sostanze con le due fasi: quindi dal meccanismo di separazione

12 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 12 CHE VALORI DEVE AVERE? Per effettuare una buona separazione cromatografica fra le due sostanze, è necessario che α sia maggiore di 1 e in pratica è consigliabile che sia maggiore di 1,2.

13 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 13 FINE 1° PARTE

14 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 14 DOMANDE RIPASSO 1)Qual è la missione dell’analista che utilizza la cromatografia strumentale? 1)Cosa si intende per Kc? 1)Cosa fare se 2 sostanze hanno simile Kc? 1)Cosa succede se in un sistema cromatografico una sostanza ha Kc=0? 1)Posso ricavare il fattore di ritenzione dal cromatogramma? 1)Cosa significa se due sostanze hanno il fattore di selettività uguale a 1?

15 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 SELETTIVITA ’ SELETTIVITA ’ Una separazione cromatografica per essere efficace deve essere selettiva: le sostanze devo uscire in tempi distanti l ’ una dall ’ altra in modo da avere picchi separati La selettività di un sistema cromatografico viene espressa dal cosiddetto fattore di separazione o ritenzione relativa α = t' R2 \t' R1 Dipende dal tipo di interazione delle sostanze con le due fasi: quindi dal meccanismo di separazione

16 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 16 Agendo su Kc/k/alfa si interviene sulla velocità di uscita degli analiti ma come intervenire sull' ampiezza dei picchi?

17 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 17 NON SOLO SELETTIVITA’ MA ANCHE EFFICIENZA L ’ efficienza indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande strette, che forniscono picchi molto stretti Il parametro più semplice con cui esprimere l ’ efficienza è la larghezza alla base del picco (wb), che in genere è diversa per ogni specie chimica in un dato sistema Cromatografico.

18 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 18 Risoluzione cromatografica Efficienza e selettività influenzano il risultato finale della separazione cioè il grado di separazione dei picchi ottenuti al rivelatore di un sistema cromatografico; La risoluzione misura la capacità di un sistema cromatografico di separare due analiti con caratteristiche simili: bande ben separate lungo la colonna generano picchi distinti e sufficientemente stretti da non sovrapporsi. In tal caso si dice che i picchi sono “ ben risolti ”. : Se la risoluzione non è sufficiente (R < 1), i due picchi non possono essere quantificati in maniera corretta

19 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 19 AnalisiHPLC olio essenziale Camomilla

20 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 20 Storicamente il primo approccio teorico ha tenuto conto: 1) il picco e' una gaussiana: posso usare parametri statistici per interpretarlo 2) la colonna cromatografica assomiglia ad una colonna di distillazione: teoria dei piatti Come si arriva a pianificare una separazione selettiva efficiente e quindi con picchi ben risolti? Come si arriva a pianificare una separazione selettiva efficiente e quindi con picchi ben risolti?

21 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 21 Teoria dei piatti (1941 da Martin e Synge) immaginato Il sistema cromatografico è immaginato simile ad una colonna di distillazione, cioè composta da una serie di strati sottili orizzontali contigui chiamati piatti teorici; Il piatto teorico è: l’ideale tratto di colonna in l’analita si trova in equilibrio tra le due fasi prima che l’eluente lo trascini nella fase successiva in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza, durante l ’ eluizione un equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. (A) fase mobile (A) fase stazionaria

22 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 22 Lo spostamento di una specie chimica durante l’eluizione ha luogo attraverso una serie di equilibri in cui avvengono una serie di trasferimenti successivi delle molecole tra le due fasi. L’efficienza della separazione dipenderà dal numero di situazioni di equilibrio che si possono instaurare e quindi dal numero di piatti teorici. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione migliore Più sottile è l’altezza del piatto (HEPT) maggiore sarà il suo numero a parità di lunghezzaN=L/H N ( numero piatti teorici) è proporzionale alla lunghezza della colonna. Questa teoria ha un approccio statico non tiene conto del dinamismo del processo di eluizione cromatografica, è superata ma i termini N H e la loro relazione vengono ancora usati.

23 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 23 il picco cromatografico è una gaussiana Quindi si possono usare parametri statistici per valutare l ’ efficienza della colonna H=  2 /L N=16(tr/wb) 2 Per ogni sostanza posso ricavare dal cromatogramma il numero di piatti

24 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 24 EFFETTO DEL N° DI PIATTI SUL PICCO Maggiore è il numero di piatti più compatto è il picco RIASSUMENDO: La teoria dei piatti spiega la separazione mettendola in funzione della costante di distribuzione e dell ’ altezza di H

25 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s. Calcolate: (i) il numero di piatti teorici della colonna; (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844 (ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5  m

26 CORSO ANALISI CHIMICA Cromatografia: parametri U.D.2 ITIS VIOLA A.S. 2015/2016 Esercizio