PCR Polymerase Chain Reaction Reazione a catena della DNA Polimerasi Premio Nobel per la Chimica nel 1993 assieme a Michael Smith Old Faithfull (???) Kary.

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1 PCR Polymerase Chain Reaction Reazione a catena della DNA Polimerasi Premio Nobel per la Chimica nel 1993 assieme a Michael Smith Old Faithfull (???) Kary Banks Mullis

2 PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, anche partendo da tracce di DNA estremamente complesso, come l’intero genoma umano. Primer a RNA Nuovo filamento DNA polimerasi DNA stampo Nuovo filamento Primers a RNA Il meccanismo a cui si richiama la PCR è la replicazione del DNA: REPLICAZIONE 5’5’3’3’ 5’5’3’3’ DNA stampo PCR 1 1 x 10 9 PCR DNA 3’3’ Primer oligonucleotidico 5’5’ 3’3’ DNA polimerasi Nuovo filamento 5’5’ 5’5’ 3’3’ 5’5’3’3’

3 COMPONENTI di una REAZIONE di PCR Stampo DNA Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Primers Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio Tampone contenente cloruro di magnesio Lo ione Mg 2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima Enzima Una Taq polimerasi, cioè una DNA Polimerasi termostabile. La “Taq” polimerasi è stata la prima scoperta, estratta dal batterio termofilo Thermus aquaticus Oggi ne esistono molte, tutte estratte da batteri estremofili dNTP Mg 2+

4 La PCR è una procedura che prevede cicli ripetuti, composti ciascuno da tre fasi 1) DENATURAZIONE: Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento in provetta a ~ 92-95°C 2) ANNEALING: La miscela viene raffreddata gradualmente fino a raggiungere la temperatura che garantisce la specifica ibridazione dei primers alle regioni dello stampo ad essi complementari 3) ALLUNGAMENTO: La temperatura della miscela viene portata a 70-72°C consentendo alla DNA polimerasi termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico

5 I primi 4 cicli della PCR in dettaglio DNA stampo Frammento desiderato 1° ciclo 2° ciclo 3° ciclo 4° ciclo 30° ciclo Amplificazione esponenziale 2 1 = 22 2 = 4 2 3 = 82 4 = 162 30 Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti il frammento desiderato 00 28

6 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA II ciclo denat. +

7 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA II ciclo denat. +

8 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA II ciclo denat. +

9 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA II ciclo denat. +

10 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA II cicloIII ciclo denaturazione +

11 Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA II cicloIII ciclo denaturazione + 2 3 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli

12 Ad ogni ciclo di PCR il numero di molecole di DNA bersaglio (tratto di DNA incluso tra i due primer) raddoppia. In una PCR di 30 cicli per ogni molecola di DNA inizialmente presente se ne formeranno 2 30, cioè un numero dell’ordine di 10 9. REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

13 http://youtu.be/iQsu3Kz9NYo

14 Numero di cicli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Numero di molecole di amplificati 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1.024 2.048 4.096 8.192 16.384 32.768 65.536 131.072 262.144 524.288 1.048.576 2.097.152 4.194.304 8.388.608 16.777.216 35.544.432 67.777.216 134.217.728 268.435.456 536.870.912 1.073.741.724 Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una singola copia di DNA Y= N2 n Y= numero molecole di DNA amplificato N= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR

15 Log [DNA] N° cicli Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile Resa teorica: 2 n P =(2) n T Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n). P dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

16 Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Riappaiamento dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

17 Scelta dei primers Condizioni di reazione Contaminazione Specificità Sensibilità Scelta dei primers Complessità e quantità del DNA su cui si amplifica Presenza di inibitori Tipo di campione Efficienza della reazione Riproducibilità Standardizzazione delle fasi del metodo:  preparazione del campione  protocollo di PCR  sistema di rivelazione PRINCIPALI FATTORI CHE INFLUENZANO LA RESA DELLA PCR

18 Specificità dei Primers per la PCR Specificità  lunghezza E’ il parametro più importante, perchè la specificità della PCR dipende fondamentalmente dalla specificità dei primers. Il fattore che determina in modo predominante la specificità dei primers è la loro lunghezza; maggiore la lunghezza, maggiore la specificità Questo è comprensibile grazie a considerazioni di tipo probabilistico. Infatti in pratica con primers “specifici” si intendono quei primers che sono in grado di riconoscere in una DNA molto complesso come quello di un intero genoma solamente la sequenza ad essi complementare. La domanda da porsi in sostanza è: se scelgo un primer lungo n nucleotidi, con quale PROBABILITA’ mi aspetto di trovare la sequenza scelta sul DNA target? Poichè le basi sono di 4 tipi la probabilità che la sequenza di un primer di n basi sia “unica” è P=1/ 4 n Con n=5 P=9.77x10 -2 con n=10 P =9.5410 -7 con n=16 P=2.32 10 -10 n=20 P=9.1x10 -13 Come si vede con primers lunghi 16-20 nucleotidi si è abbastanza al sicuro per quanto riguarda la specificità, anche considerando DNA target in genomi molto complessi come quello umano. Infatti considerato che il genoma umano è in tutto 3 10 9 bp, un primer lungo 20 ha una P di 9.1x10 -13 di capitare sul genoma umano altrove PER CASO; cioè ogni 1/9.1 10 -13 coppie di basi = 1 ogni circa 10 12 coppie di basi….

19 CARATTERISTICHE dei PRIMERS Caratteristiche di un buon primer: Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 4 16 bp (~ 1 ogni 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano. Lunghezza: 16 bp o più, tipicamente 20 nucleotidi La T m dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers La T annealing è in genere circa 5°C al di sotto della T m dei primers usati T m primer 1 T m primer 2 ~  Se la temperatura di melting e quindi di annealing dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento. T m vuol dire Temperatura di melting. E’ quella temperatura alla quale il primers si dissocia dal DNA. Dipende dalla composizione in basi del primer. Ci sono due formule per calcolarla, la prima è imprecisa e facile: T m = 4(G+C)+2(A+T)°C La seconda formula è quella precisa (K è la forza ionica della reazione di PCR, len è la lunghezza del primer): T m = 0.41 x (% G+C) + 16.6 x log[K(+)] - 675 / len + 81.5 Comunque la calcolano automaticamente i programmi con i quali si “cercano” i primers su un DNA da amplificare Quando si fa la PCR la temperatura a cui si fa l’associazione del primer sul DNA deve essere ovviamente più bassa della temperatura di melting che è quella di dissociazione del primer dallo stampo di DNA. Quindi nella PCR il primer si utilizza a una temperatura di annealing Ta che è circa più bassa di quella di melting

20 - I primers devono essere progettati in modo da NON avare omologie interne superiori a 3 basi. Altrimenti formano strutture a forcina che sono negative per la PCR Contenuto in G/C - idealmente un primer dovrebbe avere un contenuto di G/C e A/T bilanciato, intorno al 50% ciascuna coppia - I primers non dovrebbero contenere “runs” cioè successioni di C e G oltre 3 massimo perchè altrimenti il rischio di annealing aspecifico aumenta significativamente Regione al 3’ del primer - La sequenza al 3' del primer è essenziale per il controllo e la minimizzazione di falsi inneschi. - l’inclusione di una G o C all’estremità 3' end dei primers aiuta l’innesco della sinetsi da parte della DNA polimerasi stabilizzando meglio la coppia di basi rispetto a una eventiuale coppia A/T Sequenze complementari interne ai primers - Un altro pericolo è che la omologia intrasequenza o tra i due primers che possono portare alla formazione di associazioni tra primerss che interferiscono con la PCR abbassandone la resa (dimeri dei primers soprattutto) se l’omologia è al 3’ Disegno dei Primers – assenza di ripetizioni interne

21 La scelta dei primers si può fare in rete su siti appositi Tra i molti tools online si può usare quello che si chiama Primer3 http://primer3.ut.ee/ Le opzioni di utilizzo e i parametri impostabili sono moltissimi ma il programma ha impostazioni standard che vanno bene per la maggior parte dei casi Tools come Primer3 selezionano coppie di primers ottimizzate per la PCR sulla sequenza target fornita dall’utente

22 Precauzioni da adottare nella predisposizione della miscela di reazione per una PCR Non utilizzare quantità eccessive di stampo, primers e/o dNTP al fine di evitare amplificazioni non specifiche. Dosare accuratamente la [Mg 2+ ] in funzione della quantità di stampo, primers e dNTP utilizzata Mg 2+ è indispensabile al funzionamento della Taq polimerasi, ma è chelato da stampo, primers e dNTP. Se in eccesso causa una perdita di fedeltà da parte dell’enzima.  Selezionare l’enzima più idoneo alle proprie necessità Emivita alla temperatura di denaturazione Processività Capacità di correzione degli errori Taq, Pfu...

23 I FATTORI CRITICI della PCR nella programmazione dell’esperimento 94°C 1’ 72°C 1’ Emivita* Taq polimerasi: 30 min a 95°C~30 cicli di denaturazione di 1 min T DEN › 95°C o N. cicli › 30 Diminuire il tempo di denaturazione/ciclo  60°C 30’’ TEMPERATURA e TEMPO di ANNEALING DEI PRIMERS T ANN troppo bassa  amplificazione aspecifica  T ANN troppo altaamplificazione con bassa resa T ANN ~ T MELTING o primers lunghi   Allungare il tempo di annealing TEMPERATURA e TEMPO di ALLUNGAMENTO TEMPERATURA: 70-72°C a seconda dell’enzima TEMPO: 1min / Kb di amplificato (1’ si usa comunque anche per prodotti di PCR sotto 1 Kb. 1 Kb = 1000 bp) ALLUNGAMENTO FINALE di 7-10 min per completare la sintesi degli eventuali prodotti parziali * Il tempo nel quale l’enzima perde il 50% di attività TEMPERATURA e TEMPO di DENATURAZIONE

24 STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’ DELLA PCR: TOUCHDOWN PCR TOUCHDOWN PCR Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec T m (+5°C) -0.5°C/ciclo All. 1 min/Kb 72°C 10 cicli Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec T m (-5°C) All. 1 min/Kb 72°C 20 cicli Den. iniziale 3-5 min 94°C 1 ciclo    All. finale 7 min72°C 1 ciclo Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec T m All. 1 min/Kb 72°C 30 cicli Den. iniziale 3-5 min 94°C 1 ciclo   All. finale 7 min72°C 1 ciclo PCR CLASSICA In sostanza nella touchdown PCR non si fanno 30 cicli tutti uguali come nella PCR standard (sinistra); al contrario durante i primi 10 cicli ad ogni ciclo lo step dell’annealing prevede di abbassare la TM di 0.5°C alla volta (destra in verde). Ad esempio, ipotizziamo una PCR con annealing dei primer a 53°C. Nella PCR standard OGNI ciclo dei 30 avrebbe denaturazione, poi annealing a 53°C e poi allungamento. Nella PCR touchdown il primo ciclo sarebbe con annelaing a 58°C, il secondo a 57.5°C il terzo a 57°C il quarto a 56.5°C e via così fino al decimo ciclo che sarebbe con annealing a 53°C. A questo punto i rimanenti 20 cicli sarebbero tutti con annealing a 53°C

25 ALTRE STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’ DELLA PCR HOT STARTNESTED PRIMER PCR La PCR “hot start” previene la formazione di questi prodotti non specifici in quanto un componente chiave della miscela di reazione (enzima o MgCl 2 ) viene aggiunto dopo lo step di denaturazione iniziale. Durante l’allestimento della reazione di PCR o durante il riscaldamento iniziale del campione si possono verificare situazioni di appaiamento non specifico fra primers e stampo. Fra 40 e 50°C la Taq polimerasi ha un’efficiente attività polimerasica e può estendere i primers non correttamente appaiati. Perché realizzare una PCR “hot start”? Enzimi “Hot start” (AmpliTaq Gold; anticorpi; SELEX) Gocce di cera L’amplificazione è realizzata con un set di primers Il prodotto è riamplificato con un set di primers interni ai precedenti I prodotti non specifici amplificati nella I a PCR non saranno amplificati nella II a 5’5’ 3’3’ 3’3’5’5’ 5’5’ 3’3’ 3’3’ 5’5’ I a PCR II a PCR 5’5’ 3’3’ 3’3’5’5’ 5’5’ 3’3’ 5’5’ 3’3’ pr. nested Nella Hot Start la Taq polimerasi è modificata e si attiva SOLO nella fase della denaturazione Nella Nested Primers PCR dopo la prima PCR si esegue una seconda PCR sui prodotti della prima PCR usando un a coppia di primers nuova, scelta INTERNAMENTE al prodotto di PCR

26 UNA PARTICOLARITA’ dei PRODOTTI di PCR – Il TA Cloning La Taq polimerasi e le altre polimerasi per PCR hanno una particolare attività enzimatica che aggiunge un singolo nucleotide all’estremità 3‘dei prodotti di PCR. In presenza dei 4 trifosfati (dNTPs) è preferenzialmente aggiunto dA. Quindi un prodotto di PCR ha sempre una base (A) che sporge al 3’ che NON ERA PRESENTE sullo stampo Quindi un prodotto di PCR non ha estremità “piatte” e come tale non si può saldare a un qualunque altro frammento (un vettore plasmidico per clonare il prodotto di PCR ad esempio). O meglio, è necessario usare plasmidi modificati che hanno una coppia di T che sporgono alle loro estremità Questa particolare procedura di clonaggio dei prodotti di PCR si chiama TA-cloning 5’5’ A -3’ 5’5’ 3’-A3’-A 5’5’ 5’5’ 3’-A3’-A T T

27 APPLICAZIONI della PCR diagnostica molecolare clinica; diagnosi prenatali identificazione di cellule tumorali, di infezioni batteriche e virali; analisi della variabilità genetica di popolazioni; analisi di DNA antico analisi di campioni biologici in medicina legale: “DNA Forense” analisi di campioni per controlli qualità e sicurezza alimenti analisi ambientali sequenziamento di DNA Clonaggio e manipolazione dei geni (adattatori, linkers, MCS, spaziatori etc.); Mutagenesi casuale o sito-specifica; Produzione di sonde oligonucleotidiche; analisi di genoteche/identificazione e caratterizzazione di cloni ricombinanti; analisi di espressione ………………

28 Snustad, Simmons – Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15 Diagnostica Molecolare della Anemia Falciforme con PCR e RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

29 Snustad, Simmons – Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15 Diagnostica Molecolare della Anemia Falciforme con PCR e RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

30 DIAGNOSTICA degli OGM negli ALIMENTI   TEST sulle PROTEINE  Rilevazione immunologica della proteina codificata dal transgene (ELISA) - Quali- / quantitativo - Rapido - Test da campo Richiede materie prime non lavorate L’espressione delle proteine è spesso tessuto-specifica e sviluppo-dipendente - - TEST sul DNA  Ricerca del transgene e di sequenze ad esso correlate (PCR e Real-time PCR) - Quali- / quantitativo - Rapido - Sensibile (limite = 0.0001%) - Degradazione del DNA - Presenza di inibitori della polimerasi Possibili contaminazioni con DNA estraneo Non tutti i derivati alimentari contengono DNA (es. olio di semi di mais) - -

31 Analisi qualitativa (screening) I° STEP Rivela la presenza/assenza dell’OGM nel campione Si ricerca la presenza di sequenze di DNA comuni alla maggior parte degli OGM risultato positivo Si identifica il transgene presente, verificando se è uno di quelli autorizzati in commercio risultato negativo L’analisi si arresta Nessun transgene autorizzato Alimento illegale Transgene autorizzato II° STEP Analisi quantitativa con PCR Real Time Se i singoli ingredienti superano la percentuale dell’1% scatta l’obbligo di riportarne la presenza in etichetta PROCEDURA per il RILEVAMENTO di OGM negli alimenti mediante TEST sul DNA

32 GENI BERSAGLIO nell’analisi qualitativa degli alimenti Individuazione del transgene Elementi caratteristici dei costrutti ricombinanti (i transgeni) Promotore CaMV 35S Transgene tNOS Gene marcatore Promotore CaMV 35S tNOS* Gene marcatore PCR QUALITATIVA Amplificazione di una delle seguenti sequenze: Amplificazione di geni sicuramente presenti nel campione (es. lectina della soia, zeina del mais) PCR QUANTITATIVA (è disponibile una banca dati che contiene tutte le sequenze di DNA depositate nei brevetti a livello mondiale) * Terminatore del gene della Nopalina sintetasi

33 Amplificazione sequenza bersaglio + quantificazione dell’espressione genica identificazione del prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici (in alcuni sistemi) analisi simultanea di due (o più) campioni nella stessa reazione individuazione di mutazioni puntiformi … on-line e in tempo reale!     REAL-TIME PCR

34 2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE... La soia Roundup Ready (Monsanto) è stata modificata geneticamente per resistere alla somministrazione del glifosato, un diserbante ad ampio spettro. Soia Roundup Ready Per quantificare mais e soia transgenici negli alimenti sono state opportunamente disegnate combinazioni di Sonde di Ibridazione che riconoscono tanto il transgene quanto un gene endogeno, rendendo possibile quantificare simultaneamente sia il contenuto di mais/soia GM che di mais/soia totale nel campione in analisi. Sonda 1 specifica per il transgene cryIA(b) (Endotossina delta), codificante per la tossina Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per l’enzima invertasi Sonda 1 specifica per il transgene CP4-EPSPS ( 5-Enol-pyruvylshikimate-3- phosphate synthase from Agrobacterium sp. CP4) Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per la lectina Mais Bt di un gene che codifica per una tossina insetticida Il mais-BT è stato reso resistente alla piralide mediante l’inserimento derivata dal batterio Bacillus turingiensis la cui ingestione provoca la morte delle larve paralizzandone l’intestino.