Il topo comune: Mus musculus

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1 Il topo comune: Mus musculus
Gestazione: 3 settimane 8-9 settimane dalla nascita: adulto Allo stadio di 64 cellule: 13 sono ICM (Inner Cell Mass) è la fonte delle Cellule Embrionali Staminali)

2 Mus musculus: ciclo vitale
5-10 nidiate/anno 5-10 cuccioli/nidiata 19-21 giorni di gestazione Maturità sessuale a 7 settimane 4-5 generazioni per anno

3 Mus musculus: caratteristiche del topo di laboratorio
Ceppi inbred: accoppiamento fratello-sorella per almeno 30 generazioni successive: 98.6% di omozigosi a tutti i loci Variabilità genetica nella popolazione diminuita Possibilità di fissare uno specifico fenotipo

4 Mus musculus e Rattus norvegicus: completato il sequenziamento dei genomi
2002 2004

5 Genoma di topo: 2500 Mb 19 autosomi + X, Y Geni: circa 25000
Pubblicazioni topo ratto cane Drosophila zebrafish C. elegans Genoma di topo: 2500 Mb 19 autosomi + X, Y Geni: circa 25000 Progenitore comune: 80 mln anni fa

6 Mappa di sintenia Uomo-Topo
SINTENIA: CONSERVAZIONE DELL’ORDINE LUNGO IL CROMOSOMA DI GENI ORTOLOGHI IN UOMO E TOPO

7 Molte malattie genetiche umane hanno una controparte nel topo.
Mus musculus: eccellente modello genetico per lo studio dello sviluppo dei vertebrati White spotting Piebaldismo Molte malattie genetiche umane hanno una controparte nel topo. Creazione di topi transgenici o knock-out. Consorzio Internazionale per la creazione di topi knock-out istituito 2007:

8 Mus musculus e Rattus norvegicus: applicazioni
Modelli transgenici per: malattia di Alzheimer, sclerosi laterale, corea di Huntington , distrofie muscolari, tumorigenesi, ipertensione, malattie neurodegenerative, disordini psichiatrici (alterazioni comportamento, dipendenze), diabete, malattie autoimmuni (artride reumatide), rigenerazione tissutale e ossea, trapianti, tossicità dei farmaci

9 TRANSGENESI IN Mus musculus
Creazione di animali geneticamente modificati per: conferma di gene candidato responsabile di una patologia umana - studio della funzione e della regolazione di un gene modelli animali per lo studio delle malattie umane modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (“rescue” fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica Un organismo si considera transgenico quando il gene endogeno modificato o il gene esogeno introdotto è: • integrato nel suo genoma; • espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale; • integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.

10 TRANSGENESI IN M. musculus
Malattie con aploinsufficienza ( analisi dell’eterozigote) Malattie dominanti: alleli con acquisizione di funzione - introduzione della mutazione patologica nel gene endogeno - introduzione dell’allele esogeno mutato senza soppressione endogeno o con soppressione endogeno - inserimento di più copie del gene endogeno o di promotore forte (aumento di funzione) Malattie recessive: produzione di ko del gene endogeno

11 TRANSGENESI IN M. musculus
KNOCK IN Introduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo. Aumento del numero di copie gene endogeno studio della sovraespressione Inserimento di un intero gene esogeno o solo alcuni esoni può contemporaneamente determinare l’inattivazione del gene endogeno KNOCK OUT Introduzione di sequenza genica per l’abolizione della funzione genica endogena Inattivazione genica costitutiva ESPRESSIONE INDUCIBILE DI UN TRANSGENE Attivazione o inattivazione genica condizionale (nel tempo e nello spazio)

12 TRANSGENESI IN M. musculus
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO 1) Trasferimento genico diretto: Trasfezione DNA libero con microiniezione 2) Trasferimento tramite vettori (adenovirus, virus adeno associati, retrovirus): infezione virale 3) Metodi: Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti 4) Tipi di inserzione: ectopica mirata

13 Inserzione ectopica: effetto di posizione
Influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori) Influenza struttura cromatina (eterocromatina, DNA ipermetilato) Inserzione mirata Inserimento nel genoma in una posizione occupata da sequenza omologa Controllo di espressione del transgene Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40) per geni sempre attivi e molto espressi Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente

14 Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
(accoppiata con maschio vasectomizzato)

15 Inserzione mirata: produzione Knock-out/in per ricombinazione

16 Inserzione mirata: produzione Knock-out/in per ricombinazione omologa
DNA esogeno DNA genomico

17 Inserzione mirata: produzione Knock-out/in per ricombinazione omologa

18 Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
Si microiniettano molti oociti fecondati (circa 200 oociti da 7-8 femmine dopo induzione superovulazione) Da ogni oocita fecondato si sviluppa un topo Individuazione topo transgenico

19 Trasferimento genico tramite trasferimento nucleare
fecondato Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà l’intero sviluppo

20 Metodi per produzione di topi transgenici
Microiniezione nel pronucleo: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico (comprese cellule germinali) - Trasferimento nucleare: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico Trasfezione (o elettroporazione) di cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti, l’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali sono transgenizzate)

21 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo l’accoppiamento. Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il differenziamento: totipotenti Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e capacità differenziative limitati)

22 Formazione della blastocisti

23 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
NO è una CHIMERA!!! Zigote Mutazione genetica in due popolazioni cellulari Mosaico una delle cellule Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari Chimera Zigote 2 (cellula ES transgenica)

24 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
Solo alcuni topi produrranno gameti con il transgene da cui deriveranno topi transgenici

25 Cellule embrionali staminali (ES) con transgene sono reimpiantate in blastocisti

26 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko
Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir Vettore con: gene tk (timidino-chinasi) (tk+ ) dell’Herpes virus (tk HSV), gene della Neomicina resistenza = neoR Gene endogeno inattivato per inserzione mirata del gene neoR Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA

27 Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir
G418: analogo della neomicina Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito Gcv Gcv-P Gcv-PPP Incorporazione DNA Terminazione catena rottura DNA Tk HSV Tk mammifero

28 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko
Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

29 Produzione di topo ko (in omozigosi) successiva a mutazione mirata
Aguti Fenotipo ko = Coda arricciata

30 Topi transgenici Topo nero: apparentemente
nessun contributo di cellule ES Topo fondatore chimerico: forte contributo delle cellule ES Topo fondatore chimerico: debole contributo delle cellule ES

31 Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko
Background genetico del topo: influenza sull’espressione del transgene (geni modificatori) Utilizzo di ceppi (strain) diversi nelle varie fasi della produzione e mantenimento ko Produzione cellule ES di solito dal ceppo 129 (mantello agouti o bianco) Inserimento cellule ES in blastocisti C57BL/6 (mantello nero) (staminali C57BL/6 meno efficienti nell’attecchimento) Maggiore è il contributo del genoma delle ES maggiormente sarà agouti il mantello Problematiche del KO dal ceppo 129: difficoltà di accoppiamento, alterazioni comportamentali, anatomiche, immunologiche) Mantenimento ceppo 129 KO: reincroci con C57BL/6 (animale robusto, alta fertilità) Creazione ceppo congenico: topo ko con contributo genetico minimo delle ES nel genoma di C57BL/6 (al minimo regione contenente il transgene!)

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33 Produzione di organismo Knock-in per ricombinazione
e sostituzione di un gene cromosomico con un transgene Doppia ricombinazione omologa (X) che (esclude tk e inserisce Neo): grande delezione dell’esone 1 endogeno ed ingresso del transgene che viene trascritto a partire dal P del gene endogeno. Marcatore Neo con Promotore per la selezione delle cellule ES in cui è avvenuta la sostituzione; gene tk per selezione negativa

34 Produzione di organismo Knock-in per ricombinazione
e sostituzione di un gene cromosomico con un transgene Inserzione del gene LacZ nel gene Evc murino. LacZ sotto controllo trascrizionale degli elementi regolativi del gene Evc Colorazione dopo X-gal SI STUDIANO DUE ASPETTI: - CONSEGUENZE INATTIVAZIONE - NORMALE PATTERN DI ESPRESSIONE TISSUTALE Sindrome Ellis van Creveld (AR): acondroplasia associata con alterazioni dello sviluppo della cute, dei capelli e dei denti, polidattilia e con difetti del setto cardiaco Embrione Evc +/- Forte espressione nelle regioni della bocca Creazione omozigoti Evc-/-

35 Produzione di topo knock out Evc -/- ed analisi fenotipica
Arti corti e anomalie scheletriche osso cartilagine Anomalie nella dentizione

36 Espressione inducibile di un gene
Si può regolare l’espressione di un gene spazio-temporalmente E’ necessario che il gene sia integrato e stabile nelle cellule Si può studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene: - mantenuto “spento” durante l’espansione della coltura - “acceso” al momento dell’esperimento Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tet) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox). Tet-On: l’aggiunta di Tet o Dox “accende” il gene Tet-Off: l’aggiunta di Tet o Dox mantiene “spento” il gene

37 Espressione inducibile di un gene
Il sistema P e tetR (repressore della tetraciclina di E. coli) inserito nel genoma in modo indipendente Transgene con operatore tet di E. coli Introduzione nel mezzo di un analogo della tetraciclina: Dox

38 Espressione inducibile di un gene
Ormone della crescita del ratto (GF) clonato a valle del promotore del gene della metallotioneina murina regolata dai metalli pesanti Risultato: ANIMALI GRANDI Topi alimentati con zinco sono 2-3 volte più grandi

39 Inattivazione genica condizionale
Ricombinazione sito-specifica guidata dal sistema Cre-LoxP Ricombinasi Cre: enzima che fa parte della famiglia delle integrasi ricombinasi sito-specifiche. La ricombinasi Cre è presente in natura nel batteriofago P1 ed ha un ruolo nel ciclo lisogenico, in quanto serve per l’integrazione del genoma fagico in quello batterico La ricombinasi è in grado di riconoscere specifiche sequenze di DNA chiamati siti LoxP (locus del X-over P1) Filamenti di DNA fiancheggiati da una coppia siti LoxP vengono definiti “floxed” o “floxati”. I siti loxP sono costituiti da due distinte sequenze palindromiche di 13 nucleotidi ciascuna interrotte da una sequenza asimmetrica di 8 nucleotidi detta “spacer” che conferisce direzionalità al sito. Siti di riconoscimento loxP Siti di riconoscimento FRT (Flippasi che deriva dal 2 micron di S. cerevisiae

40 Inattivazione genica condizionale
Ricombinazione sito-specifica guidata dal sistema Cre-LoxP Utilizzo di promotori tessuto specifici eterozigote per locus (A/a per knock-out) in omozigosi La ricombinasi Cre riconosce appaiamento di siti loxP e taglia

41 Sistema Cre-loxP per knock-out genico tempo- e tessuto-specifico

42 Topi come modello per i tumori
- Inserimento di un oncogene con promotore specifico Perdita dell’oncosoppressore per ricombinazione Cre-LoxP Studio di attivazioni improprie di un oncogene Mutanti condizionali: espressione dell’oncogene in tessuti specifici. Esempio BRCA1: 50% tumori mammari umani Mancanza Brca1 causa morte embrionale topo ; sistema CreLoxP e rimozione esone 11 solo in cellule epiteliali tessuto mammario Mutanti condizionali per Brca1 e p53: accelerazione sviluppo tumore

43 MALATTIE DA MUTAZIONI DINAMICHE
ESPANSIONI DI RIPETIZIONI IN SEQUENZE GENICHE CODIFICANTI (CAG)n = poliglutammine

44 APPROCCI PER OTTENERE UN MODELLO ANIMALE DI TOPO PER LA COREA DI HUNTINGTON
1999: Ceppo R6/2: Iniezione pronucleo maschile di un transgene con promotore HD umano + esone 1 espanso. Disturbi rapidamente progressivi come forme giovanili. Inclusioni nucleari in striato e ippocampo Promotore inducibile dalla doxiciclina: aggregati rimossi dal cervello spegnendo il gene = sintomi reversibili Inserzione casuale del cDNA del gene HD umano

45 APPROCCI PER OTTENERE UN MODELLO ANIMALE DI TOPO PER LA COREA DI HUNTINGTON
Gene HD completo di promotore, esoni e introni. Microiniezione nel pronucleo di uno YAC Inserimento nel gene Hd murino dell’esone 1 di HD umano Modelli più usati: R6/2 e YAC 128 associati a fenotipi gravi

46 Per trasferire geni di grandi dimensioni (300-1000 kb)
Utilizzo di YAC (Yeast Artificial Chromosome) per produrre topi transgenici Per trasferire geni di grandi dimensioni ( kb) Metodi Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito dopo trattamento della parete) + cellule ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito) 2) Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si frammenta) 3) Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)

47 Utilizzo di YAC (Yeast Artificial Chromosome) per produrre
topi transgenici

48 ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI

49 I topi sono sempre un buon modello?
Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane Topo NOD: topo diabetico non obeso (NOD) è un modello molto bene studiato del diabete autoimmune diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulino-dipendente umano Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lieve della DMD Difficile ottenere modelli di alcuni tumori umani Impossibile studiare effetti di alcune infezioni virali (es: virus del raffreddore, HIV, polio): mancano di recettori specifici, naturalmente resistenti a certe infezioni. Necessità di “umanizzare” il topo perché esprima i recettori umani e possa essere infettato da virus

50 I topi sono sempre un buon modello?
Differenze nell’assetto genetico (non esistono certi ortologhi; esistenza di geni modificatori; ridondanza genetica) Differenze nel background genetico (topi di laboratorio inbred, popolazione umana outbred) Differenze nelle vie biochimiche e metaboliche Differenze nelle fisiologia delle cellule percorsi di sviluppo embrionale Differenze nella struttura e funzioni del cervello Differenze nella sensibilità ad alcuni patogeni Durata della vita media (esordio tardivo nell’uomo) Differenze nel nei telomeri e nella telomerasi (enzima più attivo: minore erosione cromosomica e senescenza cellulare nel topo)