ITIS BELLUZZI A.S. 2009/010 Classi 2Ba, 2AA e 2° (prof.ssa A. Felisa) LABORATORIO DI BIOLOGIA SULLA CREAZIONE DI UN OGM In collaborazione con la Fondazione.

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1 ITIS BELLUZZI A.S. 2009/010 Classi 2Ba, 2AA e 2° (prof.ssa A. Felisa) LABORATORIO DI BIOLOGIA SULLA CREAZIONE DI UN OGM In collaborazione con la Fondazione Marino Golinelli

2 Classe 2BA

3 A cura di: Gabriele Massarenti Anno scolastico 2009/2010 C lasse 2^BAmplio La Trasformazione batterica La trasformazione batterica è una tecnica di biologia molecolare messa a punto per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri. Questo processo si ottiene modificando alcune proprietà chimiche delle pareti e delle membrane cellulari con l'impiego di sostanze chimiche come CaCl2, associate a rapidi sbalzi di temperatura o di scariche elettriche ad alto voltaggio (elettroporazione Figura 1). Si forma così una temporanea permeabilizzazione delle cellule dovuta allo shock termico che indebolirà la membrana dell'Escherichia coli, formando delle aperture che permetteranno al plasmide di entrare. Il plasmide modificato, usato nel nostro esperimento contiene il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP) appartenente ad una medusa (Aequorea victoria) e conferisce al batterio Escherichia coli la fluorescenza. Questo avviene solo in presenza dello zucchero arabinosio (induttore). Nel plasmide inoltre c'è anche il gene che dà la resistenza all'ampicillina (è un antibiotico ); per cui i batteri trasformati saranno fluorescenti in presenza di arabinosio e saranno anche resistenti all'ampicillina. I batteri non trasformati moriranno in presenza di ampicillina.

4 Figura 1 elettroporatore

5 Figura 2 lucciola contente il gene Green Fluorescent Protein (GFP)

6 Escherichia coli È una delle specie principali di b b b b b aaaa tttt tttt eeee rrrr iiii che vivono nella parte inferiore dell' iiii nnnn tttt eeee ssss tttt iiii nnnn oooo di animali a sangue caldo (inclusi gli u u u u u cccc cccc eeee llll llll iiii e i m m m m m aaaa mmmm mmmm iiii ffff eeee rrrr iiii), sono necessari per la digestione corretta del cibo. La sua presenza nelle f f f f f aaaa llll dddd eeee aaaa cccc qqqq uuuu iiii ffff eeee rrrr eeee è un indicatore comune di contaminazione da feci Alcuni ceppi di Escherichia coli sono tossigenici, producono cioè t t t t t oooo ssss ssss iiii nnnn eeee che possono essere causa di dddd iiii aaaa rrrr rrrr eeee aaaa. La d d d d d iiii ssss ssss eeee nnnn tttt eeee rrrr iiii aaaa da Escherichia coli è una comune tttt oooo ssss ssss iiii nnnn ffff eeee zzzz iiii oooo nnnn eeee alimentare, poiché viene contratta principalmente da alimenti contaminati. La contaminazione può avvenire da carni infette non adeguatamente cotte, da latte non p p p p p aaaa ssss tttt oooo rrrr iiii zzzz zzzz aaaa tttt oooo e formaggi derivati, e da altri alimenti contaminati da feci.

7 Escherichia coli vista al microscopio elettronico a scansione

8 I batteri non hanno il nucleo, ma un solo cromosoma circolare, costituito da una molecola di DNA. Possiedono talvolta, anche molecole circolari di DNA molto più piccole, chiamate plasmidi, capaci di replicarsi indipendentemente dal cromosoma batterico. I geni dei plasmidi influenzano le caratteristiche della cellula ospite variando le sue possibilità alimentari, la resistenza agli antibiotici o altre caratteristiche del suo ciclo vitale. Una cellula batterica si dice trasformata quando acquisisce un plasmide originario o ricombinante. I batteri non hanno il nucleo, ma un solo cromosoma circolare, costituito da una molecola di DNA. Possiedono talvolta, anche molecole circolari di DNA molto più piccole, chiamate plasmidi, capaci di replicarsi indipendentemente dal cromosoma batterico. I geni dei plasmidi influenzano le caratteristiche della cellula ospite variando le sue possibilità alimentari, la resistenza agli antibiotici o altre caratteristiche del suo ciclo vitale. Una cellula batterica si dice trasformata quando acquisisce un plasmide originario o ricombinante.

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10 O.G.M. Gli OGM, definiti anche organismi transgenici, sono animali, piante o microrganismi viventi il cui patrimonio genetico è stato modificato con l’introduzione di un gene estraneo al fine di ottenere una caratteristica innovativa non presente nella varietà precedente

11 RELAZIONE DELL’ATTIVITA’ DI LABORATORIO EFFETTUATA Obiettivo:Inserire in una cellula batterica di Escherichia coli una molecola di DNA circolare (plasmide) con geni che verranno poi espressi nel fenotipo del batterio. Materiale a disposizione: 1 provetta con segno + 1 provetta con segno – 1 provetta con vario colore 2 confezioni di punte sterili con diversa grandezza per le micropipette 2 bicchieri di plastica Strumenti di misura Micropipetta da 1-10 microlitri Micropipetta da 10-100microlitri Micropipetta da 100-1000 microlitri

12 PROCEDIMENTO Procedimento Prendere la micropipetta da 1 -10 microlitri Aprire la confezione di punte sterili adatte alla micropipetta (cercando di tenere la confezione aperta giusto il tempo di prendere la punta, in modo tale che il sistema rimanga sterile) Premere con la micropipetta sulla punta fino all’incastro (N.B non bisogna toccare con le mani le punte perché non sarebbero più sterili ) Far ruotare il pulsante superiore della micropipetta fino a quando nell’indicatore compare il numero 8,00 microlitri Immergere la punta dentro la provetta contenente le cellule di Escherichia coli trattate con CaCl2 Premere il pulsante della micropipetta fino al primo stop, e successivamente rilasciarlo facendo attenzione che la punta sia completamente immersa nel liquido per evitare la formazione di bolle d’aria Mettere gli 8 microlitri prelevati dentro la provetta + schiacciando il pulsante della micropipetta fino al 2° stop Chiudere la provetta Mettere la provetta dentro un bicchiere contenente ghiaccio per fare avvenire uno shock termico (circa 5/10 minuti) Cambiare la punta della micropipetta Ruotare il pulsante della micropipetta fino a quando l’indicatore segna 2 microlitri Il plasmide utilizzato per la trasformazione, pGLO contiene il gene che codifica per la Green Fluorescent Protein (GFP)

13 Gabriele Massarenti (autore della relazione)

14 Classe 2AA

15 Immergere la punta della micropipetta dentro la provetta contenente il plasmide modificato Immergere la punta della micropipetta dentro la provetta contenente il plasmide modificato Premere il bottone della micropipetta fino al primo stop, e successivamente rilasciarlo facendo attenzione che la punta sia completamente immersa nel liquido per evitare la formazione di bolle d’aria Premere il bottone della micropipetta fino al primo stop, e successivamente rilasciarlo facendo attenzione che la punta sia completamente immersa nel liquido per evitare la formazione di bolle d’aria Mettere i microlitri prelevati dentro la provetta - schiacciando il pulsante della micropipetta fino al 2° stop Mettere i microlitri prelevati dentro la provetta - schiacciando il pulsante della micropipetta fino al 2° stop Togliere la provetta + dal contenitore con ghiaccio e immergerle dentro il porta provette di polistirolo in una vaschetta piena d’acqua a 42° C (N.B Il batterio è una creatura vivente e quindi non fa entrare nessun corpo estraneo nel suo organismo per questo si effettua uno shock termico per indebolire la membrana dell'Escherichia coli formando delle aperture che permetteranno al plasmide di entrare) Togliere la provetta + dal contenitore con ghiaccio e immergerle dentro il porta provette di polistirolo in una vaschetta piena d’acqua a 42° C (N.B Il batterio è una creatura vivente e quindi non fa entrare nessun corpo estraneo nel suo organismo per questo si effettua uno shock termico per indebolire la membrana dell'Escherichia coli formando delle aperture che permetteranno al plasmide di entrare) Dopo 90 secondi togliere le due provette dalla vasca Dopo 90 secondi togliere le due provette dalla vasca Prendere 100 µl di terreno di coltura per fare riprendere i batteri e metterli nella provetta + e ‒ Prendere 100 µl di terreno di coltura per fare riprendere i batteri e metterli nella provetta + e ‒ Mettere 200 µl di batteri selvaggi (-) in 100 µl di brodo di coltura Mettere 200 µl di batteri selvaggi (-) in 100 µl di brodo di coltura Attendere 10 minuti Attendere 10 minuti

16 Piastrare nel seguente modo: SEMINARE LA PROVETTA + CON OGM terreno con ampicillina SEMINARE LA PROVETTA ̶ (BATTERI SELVAGGI) terreno con ampicillina SEMINARE LA PROVETTA ̶ Batteri selvaggi TERRENO NORMALE SENZA AMPICILLINA

17 Attendere 24 ore dopo aver lasciato la piastra in termostato a 37 ° C. La fluorescenza sarà presente solo nella parte della piastra seminata con OGM (catena di soli nella figura sottostante)

18 Conclusioni: Il futuro della crisi alimentare mondiale è nelle mani delle biotecnologie. Già ora, senza OGM la situazione sarebbe ancora più preoccupante. Infatti per 12 milioni di agricoltori in tutto il mondo (che coltivano 114 milioni di ettari ad Ogm) le biotecnologie sono una realtà e hanno permesso loro di vedere aumentate i loro raccolti e di poter affrontare carestie. Con questa prova inoltre ho potuto verificare quanto sia selettiva la membrana cellulare e come si debba operare per fare entrare sostanze al suo interno. Le colonie dei batteri trasformati, se esposte a radiazioni UV, emettono una fluorescenza verde ciò è dovuto alla presenza del gene Green Fluorescent Protein (GFP). Purtroppo la parte finale dell’esperienza l’abbiamo solo “ipotizzata” in quanto gli ogm non possono uscire dai laboratori autorizzati ( e anche per mancanza di tempo). Gabriele Massarenti 2BA

19 Classe 2E