SPETTROMETRIA DI MASSA Laboratorio di Chimica Organica 2 - Prof. Cristina Cimarelli L27 - CHIMICA - AA 2015-2016.

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1 SPETTROMETRIA DI MASSA Laboratorio di Chimica Organica 2 - Prof. Cristina Cimarelli L27 - CHIMICA - AA 2015-2016

2  V tra due elettrodi sotto vuoto (1 torr) si osserva si ipotizza quindi esperimento luminescenza all’anodo particelle cariche accelerate dal  V che urtano la superficie del vetro se sono particelle cariche interagiscono con campi elettrici e magnetici determinazione sperimentale del rapporto carica/massa dell’elettrone cosa si scarica al catodo?esperimento analogo ma rapporto carica/massa molto maggiore è stato costruito il primo spettrometro di massa

3 Normalmente, quando si misura una massa, si usa una bilancia che funziona con la gravità terrestre. Come si misura la massa di una molecola, che è così piccola da non avere una interazione gravitazionale misurabile? il flusso di particelle cariche viene deviato da un campo elettrico o magnetico. Il fisico J.J. Thomson ha utilizzato questo fenomeno per sviluppare uno strumento capace di separare particelle cariche in base al numero di massa.

4 S N - + lastra fotografica anodo catodo elettrodi magnete IL PRIMO SPETTROMETRO DI MASSA Gli oggetti che passano al di là del catodo forato interagiscono con i campi elettrico e magnetico aventi linee di flusso tra loro parallele. L’interazione devia il moto delle particelle su traiettorie paraboliche, il cui fuoco dipende dal rapporto carica/massa dell’oggetto. analizzatorerivelatoresorgente ionica

5 Spettrometria di massa Ioni come particelle reali e non stati fisici legati alla soluzione Neon: scoperta degli isotopi Difetto di massa: teoria della relatività II guerra mondiale: analisi di carburanti strategici Sostanze organiche di origine naturale

6 190019502000 0 2 4 6 8 12 10 0 14 1 2 3 4 5 6 - log S (g) log MR (Da) t (anni) applicazioni fisiche applicazioni dinamiche applicazioni biomediche chimica clinica

7 Rivelatore Sistema di pompaggio Data system SPETTROMETRIA DI MASSA NELLO SPAZIO Uno spettrometro di massa comprende un dispositivo per introdurre il campione (p.es. una unità GC o HPLC), HPLC - GC Lente elettrostatica AnalizzatoreSorgente ionica interfaccia un’interfaccia per connettere tale dispositivo, una sorgente per ionizzare il campione, una lente elettrostatica che introduca efficientemente gli ioni generati, un analizzatore di massa che separi gli ioni in base al loro rapporto m/z ed un detector che riconosca gli ioni separati

8 offre una grande risoluzione, ma caratterizzare accuratamente le sostanze dal punto di vista qualitativo e quantitativo può essere difficile se più componenti vengono eluiti allo stesso tempo, come accade nelle analisi multianalita. CROMATOGRAFIA LIQUIDA rivela i singoli componenti sulla base delle loro proprietà, usando UV, fluorescenza o la conduttività elettrica. fornisce una risposta qualitativa sulla base del tempo di ritenzione, poi una quantitativa sulla base dell'intensità e dell'area del picco. separa i componenti di un campione sulla base della loro affinità o tempo di ritenzione per la fase stazionaria

9 ma l’applicazione è possibile solo quando si va a misurare un singolo componente, perché se vengono iniettati simultaneamente più componenti diventa molto difficile analizzare lo spettro. separa gli ioni risultanti sotto vuoto, sulla base del loro rapporto massa/carica, e misura l'intensità di ciascuno ione lo spettro di massa è molto utile all'analisi qualitativa perché può indicare la concentrazione degli ioni che hanno una data massa offre una tecnica altamente sensibile che ionizza i componenti del campione usando metodi diversi SPETTROMETRIA DI MASSA

10 gli spettri ottenuti da queste scansioni offrono, per i componenti eluiti, spettri di massa ed informazioni strutturali complementari alle informazioni qualitative basate sul tempo di ritenzione ottenuto usando altri rivelatori LC combinano l'eccezionale risoluzione nella separazione propria della cromatografia liquida con le eccezionali capacità qualitative della MS. SISTEMI LC-MS

11 Rivelatore Sistema di pompaggio Data system SPETTROMETRIA DI MASSA NELLO SPAZIO HPLC - GC Lente elettrostatica AnalizzatoreSorgente ionica interfaccia

12 EI - ELECTRONIC IMPACT IONIZATION (GC) TECNICHE DI IONIZZAZIONE è la tecnica piu’ utilizzata ma presenta due limiti importanti richiede la vaporizzazione del campione Interazione in fase gas dei vapori del campione con un fascio di elettroni. elevata energia trasferita alla molecola non è adatta a sostanze poco volatili favorite le reazioni di decomposizione; in alcuni casi non si evidenzia la presenza dello ione molecolare Il potenziale a cui viene effettuato l’EI è stato standardizzato a 70 eV perché a questo valore si ottengono spettri con frammentazioni riproducibili, consentendo così di costruire banche dati e di ricercare al loro interno i composti studiati.

13 campione in fase gas camera di ionizzazione ioni elettrodo di accelerazione sistema di focalizzazione filamento incandescente EI - SORGENTE AD IMPATTO ELETTRONICO

14 zV = ½ mv 2 z  carica dello ione V  potenziale della camera di ionizzazione Se V è costante, a parità di carica z, tutti gli ioni che escono dalla camera di ionizzazione hanno la stessa energia cinetica M + e -  M +. + 2e - L’energia generata all’interno della molecola dalle interazioni elettrone-molecola porta alla formazione dello ione molecolare che successivamente si decompone formando specie cationiche, anioniche, radicaliche e neutre CH j +. + D j  M +.  A j + + B j. a loro volta queste specie possono ulteriormente frammentarsi e dare luogo ad altri ioni, caratteristici della struttura molecolare. Tutti gli ioni sono sottoposti allo stesso potenziale

15 CI - CHEMICAL IONIZATION (GC) Ionizzazione chimica tramite reazioni ione-molecola in fase gassosa La sorgente utilizzata è analoga a quella della EI, con la differenza che nella camera di ionizzazione si inseriscono elevate quantità di gas reagente (0.1 torr). Generalmente vengono sfruttate reazioni acido-base del tipo: oppure reazioni di scambio di carica: Nonostante siano state superate alcune limitazioni dell’EI, questo tipo di sorgente richiede sempre campioni gassosi e non è adatto a sostanze non volatili (alto PM o molto polari) o cattura elettronica di risonanza:

16 TECNICHE A SPRAY - ESI, APCI, APPI (HPLC) Queste interfacce operano a pressione atmosferica e la ionizzazione avviene per elettronebulizzazione: gli ioni si formano da soluzioni finemente nebulizzate tramite un capillare tenuto ad alto potenziale elettrico

17 La soluzione di analita viene nebulizzata in un flusso di gas (azoto) e in presenza di un campo elettrico (2-10kV). ESI - ELECTROSPRAY IONIZATION Le goccioline cariche vengono riscaldate tramite un flusso di gas caldo, per evaporare il solvente. Non si riscaldano, perché il calore viene assorbito dall’evaporazione; il processo è adiabatico. Le goccioline diminuiscono di volume ma mantengono la carica elettrostatica. Quando la forza di Coulomb eguaglia la tensione superficiale, le goccioline esplodono, liberando gli ioni di analita (“Coulombic explosion”)

18 La soluzione di analita viene nebulizzata a pressione ambiente e ad alta T (250-400°C) in presenza di un emettitore di elettroni a corona (2-10kV). APCI - ATMOSPHERIC PRESSURE CHEMICAL IONIZATION Il solvente allo stato di vapore si ionizza e a sua volta trasferisce carica agli analiti, che quindi passano all’interno dello spettrometro. Viene impiegata in serie a cromatografie a fase diretta, perché gli analiti sono di solito non polari E’ una sorgente adatta ad un vasto range di molecole polari e non polari.

19 Anche in questo caso un vaporizzatore porta l’eluato della colonna in fase gas. TECNICHE A SPRAY - ESI, APCI, APPI (HPLC) APPI - ATMOSPHERIC PRESSURE PHOTOCHEMICAL IONIZATION Una lampada a scarica genera fotoni in un range ristretto di energie di ionizzazione, scelto per ionizzare quanti più analiti sia possibile ma mantenendo al minimo la ionizzazione del solvente. E’ una sorgente adatta ad un range di molecole analogo all’APCI, ma particolarmente utile in caso di composti fortemente non polari e basse velocità di flusso, nelle quali l’APCI a volte è meno sensibile.

20 TECNICHE A SPRAY - ESI, APCI, APPI (HPLC)

21 Rivelatore Sistema di pompaggio Data system SPETTROMETRIA DI MASSA NELLO SPAZIO HPLC - GC Lente elettrostatica AnalizzatoreSorgente ionica interfaccia

22 ANALIZZATORI A SETTORE MAGNETICO A SINGOLO O DOPPIO FUOCO ANALIZZATORI DI MASSA Gli ioni generati in una unità di ionizzazione vengono accelerati in un settore magnetico, da una differenza di potenziale da 2 a 8 kV. E’ l’analizzatore storico, in uso da più tempo. Seguendo la regola della mano sinistra di Fleming, gli ioni vengono accelerati secondo una direzione perpendicolare sia alla loro velocità che al campo magnetico, dando come risulato una traiettoria curva.

23 ANALIZZATORI A SETTORE MAGNETICO A SINGOLO O DOPPIO FUOCO Allo stesso tempo è sottoposto anche alla forza centrifuga ANALIZZATORI DI MASSA Nella traiettoria circolare le forze centrifuga e centripeta sono in equilibrio, quindi si avrà: mv 2 /r = B z e v ma l’energia cinetica dipende anche dal potenziale del campo elettrico V Lo ione è sottoposto alla forza di Lorentz (centripeta) f 1 = B z e v B  campo magneticoz  carica v  velocitàe  carica elementare f 2 = mv 2 /r m  massa r  raggio ½ mv 2 = z e V V  potenziale del campo elettrico

24 ANALIZZATORI DI MASSA Ricavando da entrambe le equazioni il termine relativo alla velocità si ha e uguagliando i termini si ottiene v = B z e r/m e v 2 = 2 V z e/m m/z = B 2 e r 2 / 2V Questo significa che mantenendo costante il potenziale di accelerazione degli ioni V e variando il flusso magnetico B (o viceversa mantenendo costante B e variando V) un detector collocato sul raggio del cammino r può rivelare qualsiasi massa particolare m. Negli attuali spettrometri a settore magnetico viene usato solo un detector di ioni e vengono mantenuti costanti sia il potenziale di accelerazione, sia il raggio della traiettoria, mentre si varia il campo magnetico. Ciò significa che ioni con masse diverse passano tutti attraverso il campo magnetico, uno dopo l’altro, e raggiungono il detector. Si ottiene uno spettro di massa da ciascuna scansione del campo magnetico.

25 ANALIZZATORI DI MASSA QUADRUPOLO TRAPPOLA IONICA (ION TRAP) TEMPO DI VOLO (TIME OF FLY - TOF) ANALIZZATORI DI MASSA HPLC

26 QUADRUPOLO Un analizzatore di massa a quadrupolo consiste di quattro barre parallelle disposte a quadrato, con potenziali opposti su barre adiacenti. Gli ioni dell’analita vengono diretti al centro del quadrato. Differenze di potenziale applicate alle barre generano campi elettromagnetici variabili, che determinano oscillazioni dello ione nello spazio. Solo ioni con un determinato rapporto m/z possono passare attraverso il filtro ad un dato tempo.

27 QUADRUPOLO Sono i detector più economici e più semplici. Possono operare in due modalità: scanning (scan mode): l’analizzatore monitora un range di valori m/z. E’ la modalità usata per l’analisi qualitativa o per la quantitativa nel caso in cui non si conoscano in anticipo le quantità dei singoli analiti selected ion monitoring (SIM mode): l’analizzatore monitora solo pochi valori m/z. Questa modalità è molto più sensibile della modalità scan, ma da informazioni su molti meno ioni. E’ impiegata per l‘analisi quantitativa e per il monitoraggio di composti target.

28 TRAPPOLA IONICA (ION TRAP) Questo sistema consiste di un elettrodo a forma di ciambella chiuso tra due altri elettrodi forati, uno adiacente alla sorgente e l’altro al detector. Si fanno entrare nella trappola gli ioni compresi in un range di rapporto m/z predefinito, scartando gli altri. Successivamente il principio è analogo al funzionamento del quadrupolo: vengono prodotte oscillazioni dello ione attraverso campi elettrici e magnetici oscillanti. La scansione dei vari valori di campo elettrico e magnetico porta all’uscita selettiva verso il detector solo degli ioni che via via hanno un determinato rapporto m/z, consentendo di rivelarli uno ad uno. In questo dispositivo è possibile anche introdurre direttamente il campione nella trappola, realizzando così lo studio solo in spettroscopia di massa

29 TEMPO DI VOLO (TIME OF FLIGHT - TOF) Un campo magnetico uniforme viene applicato a tutti gli ioni allo stesso tempo, provocandone l’accelerazione all’interno di un tubo. Ioni più leggeri percorrono il tubo più velocemente ed arrivano prima al detector. Il rapporto m/z viene quindi determinato dal tempo di arrivo. Questi analizzatori hanno un range di masse vasto e sono molto accurati.

30 RICAPITOLANDO TECNICHE DI IONIZZAZIONE ANALIZZATORI DI MASSA GC EI CI SETTORE MAGNETICO HPLC ESI APCI APPI MALDI QUADRUPOLO ION TRAP TOF

31 STRUMENTAZIONI PRESENTI NELLA SST TECNICHE DI IONIZZAZIONE ANALIZZATORI DI MASSA GCEI SETTORE MAGNETICO HPLC ESI APCI APPI QUADRUPOLO ION TRAP

32 http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/46/46intro.html http://www.shimadzu.com/an/support/index.html