CROMATOGRAFIA Estrazione Ipotizziamo di avere due composti A e B A è solubile in acqua e insolubile in etere B è solubile in egual misura sia in acqua.

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2 CROMATOGRAFIA

3 Estrazione Ipotizziamo di avere due composti A e B A è solubile in acqua e insolubile in etere B è solubile in egual misura sia in acqua che in etere

4 Abbiamo una soluzione acquosa 100ml di A+B Aggiungiamo 100 ml di etere, scuotiamo e poi lasciamo riseparare i due solventi immiscibili Nella fase acquosa troveremo A che è insolubile in etere + ½ di B che è soubile ugualmente in acqua e etere (quindi metà sarà passato in etere

5 Ai 100 ml di acqua aggiungiamo ancora 100 ml di etere Scuotiamo e lasciamo ancora separare le fasi L’Acqua conterrà A + ¼ di B, perché l’altro quarto sarà passato in etere

6 Ripetendo l’estrazione un numero infinito di volte separiamo nettamente A da B

7 La cromatografia, nata come tecnica separativa e sviluppatasi in seguito anche come tecnica analitica, si basa sul fatto che i vari componenti di una miscela tendono a ripartirsi in modo diverso tra due fasi L'invenzione della cromatografia viene attribuita al biochimico russo Michail Cvet (pronunciato e a volte trascritto Tswett) nel 1906, quando riuscì, con questa tecnica, a separare la clorofilla da un estratto vegetale. Cvet procedette ponendo una piccola quantità di estratto alla sommità di una colonna di vetro piena di polvere di carbonato di calcio e lavando successivamente il campione facendo percolare attraverso la colonna dell'etere di petrolio. A mano a mano che l'etere di petrolio fluiva trascinando con sé il campione, questi si separava in bande di diverso colore (da qui il nome "cromatografia"), ciascuna delle quali procedeva verso il fondo della colonna con diversa velocità.

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9 R f = distance moved by substance distance moved by solvent front For substances that are very soluble in the liquid R f will be close to.... For substances that are rather insoluble in the liquid R f will be close to.... 1 0

10 Cromatografia a scambio ionico su colonna

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12 Cromatografia a scambio ionico (IEC), alcuni tipi di matrici e scambiatori

13 Capacita’ di carico nella IEC: (da non confondersi con k’ !) capacita’ ionica totale  numero di scambiatori per unita’ di peso secco o di volume idratato della resina. Puo’ essere misurata per titolazione acido-base. capacita’ disponibile   la quantita’ effettiva di proteina che puo’ legarsi ad uno scambiatore in determinate condizioni sperimentali. Se queste condizioni sperimentali comprendono la velocita’ di flusso, la quantita’ legata e’ la capacita’ dinamica. La capacita’ dinamica dipende dalla dimensione della proteina e dal numero di cariche su di essa.

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16 Curve di titolazione elettroforetica cromatografica

17 Eluizione in gradiente di pH / in gradiente di forza ionica / (continuo o discontinuo) molte proteine mostrano un gradienti continui di forza ionica minimo di solubilita’ in vicinanza sono i piu’ usati in cromatografia del loro pI - inoltre c’e’ possibilita’ a scambio ionico - generalmente di denaturazione in generale per porta ad aumento di risoluzione 6 < pH < 8, alcune 5 < pH < 9, perche’ si ‘affilano’ i picchi solo la minoranza sono stabili in un ambito piu’ ampio per una proteina con molte istidine vale probabilmente la pena di provare una eluizione su gradiente di pH

18 Per ottimizzare la separazione puo’ essere necessario adottare gradienti di forma diversa Gradienti prolungati e poco ripidi daranno una migliore separazione tra i picchi ma il tempo di separazione sara’ piu’ lungo e l’allargamento dei picchi maggiore - l’opposto per gradienti corti e ripidi.

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20 Schema di funzionamento della cromatografia per filtrazione su gel

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22 t’ R V R -V 0 V i k’= = = K d t 0 V 0 V 0 V R -V 0 V 0 V R -V 0 K d = · = V 0 V i V i

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24 Applicazioni della cromatografia ad esclusione molecolare Purificazioni Determinazione M r Dissalazione Concentrazione Analisi proteina-ligando Esempi di sostanze purificate con questa tecnica: virus, proteine, enzimi, ormoni, anticorpi, acidi nucleici, polisaccaridi. Molto usata anche per separare le forme monomeriche da quelle polimeriche. A differenza dell’ elettroforesi, con questa tecnica e’ possibile la stima della massa molecolare anche in condizioni native, se si confrontano proteine di forma simile. Dal momento che le proteine e altre macromolecole biologiche hanno dimensioni molto piu’ grandi rispetto ai sali e ad altre piccole molecole, questa tecnica e’ particolarmente efficiente per rimozione di sali cambio di buffer rimozione del fenolo dal DNA rimozione di marcatori (ad es. radioattivi) dalle macromolecole marcate terminazione di reazioni Soluzioni di sostanze ad alto peso molecolare possono essere concentrate aggiungend o Sephadex G-25 secco Questa tecnica e’ comune- mente usata per studiare il legame reversibile tra macromolecole e loro ligandi a basso peso molecolare. Puo’ essere anche usata per la determinazione di costanti di equilibrio.

25 La filtrazione su gel puo’ essere usata per stimare la massa molecolare Cromatografia su Sephadex G-200. Volume di eluizione relativo verso il logaritmo della massa molecolare. Le proteine arancioni sono glicoproteine.