Spectrophotometry Instrument is called a Spectrophotometer Measures the light that passes through a liquid sample Spectrophotometer gives readings in Percent.

Presentazione sul tema: "Spectrophotometry Instrument is called a Spectrophotometer Measures the light that passes through a liquid sample Spectrophotometer gives readings in Percent."— Transcript della presentazione:

1 Spectrophotometry Instrument is called a Spectrophotometer Measures the light that passes through a liquid sample Spectrophotometer gives readings in Percent Transmittance (%T) and in Absorbance (A) http://campus.murraystate.edu/academic/faculty/judy.ratliff/UV-Vis2.htm

2 Spectrophotometry Transmittance is a measure of the amount of light transmitted through the sample Low conc. Sample  High Transmittance Percent transmittance (%T) : %T = (I/I 0 ) x 100 I0I0 I Absorbance is a calculated measure of the amount of light absorbed by the sample Low conc. Sample  Low Absorbance Absorbance (A) : A = log 10 (1/T)

3 Protein Concentration Lowry ( most cited reference in biology) –Color assay A 280 –Intrinsic absorbance –Relies on aromatic amino acids BCA –Modification of Lowry: increased sensitivity and consistency Bradford –Shifts A max of dye from 465nm to 595nm

4 A 280 Uses intrinsic absorbance Detects aromatic residues –Resonating bonds Depends on protein structure, native state and AA composition

5 Beer-Lambert Law A = Ecl where: “A” is Absorbance “E” is Molar Extinction coefficient of solute “c” is solute concentration “l” is the length of the light path For a given solute and spectrophotometer, “E” and “l” are constants Let E x l = k (k is a constant) Beer-Lambert Law becomes A = kc  Absorbance proportional to solute concentration

6 Quali sono i gruppi cromofori presenti nelle proteine? A) Nei legami peptidici si osservano le seguenti transizioni: 1) n ® p * a 210-220 nm, dai livelli di non legame n a quelli di antilegame p * 2) p ® p * a 190-210 nm, da un livello di legame p ad uno di antilegame p * 3) n ® s * a 175 nm, dai livelli di non legame n a quelli di antilegame s * B) Nelle catene laterali: a parte le transizioni comuni al legame peptidico e quindi poco osservabili, sono da ricordare i gruppi aromatici (260-280 nm), Trp, Tyr, Phe C) I gruppi prostetici

7 Quali sono i fattori che influenzano le proprietà di assorbimento di un cromoforo? 1)pH - il pH del solvente determina lo stato di ionizzazione di cromofori ionizzabili 2) la polarità - per cromofori polari, il valore di λ max per le transizioni n ® p * è minore in solventi polari (H 2 O, alcool) e maggiore in solventi non polari. 3) caratteristiche geometriche - la diversa organizzazione strutturale dei gruppi cromofori influenza fortemente sia ε che λ max.

8 Informazioni sull'accessibilità dei residui ionizzabili in proteine native. Dal momento che modificando il pH cambia lo stato di ionizzazione dei cromofori ionizzabili, cambiano anche i rispettivi λ max e ε. Perciò se cambiamo il PH: a) se non si osservano cambi spettrali per questi cromofori a pH tali per cui devono essere in forma ionizzata, questo significa che sono nascosti in una regione non polare della proteina. b) se il cambio spettrale è osservato significa che i cromofori in questione sono accessibili e, dall'esame delle curve di titolazione spettrofotometriche è possibile capire se si trovano in un intorno polare facilmente accessibile o in un intorno formato da residui apolari e poco accessibili al solvente.

9 Protein Determination Warburg-Christian Method This method is a direct spectrophotometric method. Measures absorbance at 280 nm. This method is also very sensitive to tyrosine and tryptophan. When might one use this method? Absorbance at 260 nm also used to correct for nucleic acid concentration. Wharton and McCarty, 1980

10

11

12 Determinazione della concentrazione proteica Lettura dell'assorbanza a 280 nm vantaggi: rapido, non distruttivo svantaggi: non quantitativo, poiché il metodo è basato sull'assorbimento degli aminoacidi aromatici; i coefficienti di estinzione molare saranno quindi molto diversi da proteina a proteina. Inoltre c'è una forte interferenza degli acidi nucleici. sensibilità: 0.2-2 mg/ml (scarsa) Correzione per acidi nucleici: C proteine (mg/ml) = 1,5 x A 280 - 0.75 x A 260 Tempo : pochi minuti

13 La colorimetria Numerose sostanze non hanno un coefficiente d'estinzione significativo nel visibile, ma possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a formare un prodotto colorato. Questa proprietà viene sfruttata per la determinazione quantitativa di tali sostanze. La formazione del prodotto colorato (cromoforo) deve avvenire in condizioni standardizzate secondo un rapporto stechiometrico con la sostanza e si misura quindi l'estinzione dei campioni rispetto a quella di un bianco, contenuto nella cuvetta di riferimento e costituito da tutti i reagenti tranne la sostanza da determinare.

14 E' necessario prima della misurazione dei vari campioni azzerare contro il bianco. Si pongono poi i valori delle varie letture in funzione della quantità o della concentrazione della sostanza in esame che forma il prodotto colorato. Questo grafico è la curva di taratura. A questo punto è possibile dosare quantità ignote della sostanza facendo avvenire la reazione colorimetrica nelle stesse condizioni, misurando l'estinzione ed estrapolando l'altro valore dalla curva di taratura.

15

16

17 metodo del biureto (interesse storico) Biureto: Principio: in soluzione alcalina lo ione Cu +2 forma complessi colorati in "blu" con i legami peptidici. Sale normalmente usato CuSO 4. The result is a purple color. Sensibilità : bassa 1 mg/ml Tris buffer and other substances often interfere.

18 Lowry Assay A widely-used method of measuring protein concentration A colorimetric assay –Amount of blue color proportional to amount of protein –Absorbance read using 500-750nm light Lowry et al, 1951

19

20 Chemistry of the Lowry Assay Two reactions make the blue color develop: Reaction 1 –Cu 2+ + peptide bonds  Cu 1+ -peptide bond complex –Produces purple-blue color Reaction 2 –Folin reagent + Cu 1+ -complex  reduced Folin reagent –Produces blue-green color

21 Lowry ® in aggiunta al sale di rame c'é il reattivo di Folin - Ciocalteau (fenoli) che forma compelssi colorati con Tyr a pH 10-10.5 ® soluzione alcalina Vantaggi:riproducibilità, piccole variazioni fra proteine differenti Svantaggi: Molte sostanze possono interferire, reazioni lente (40 minuti), campione non recuperabile perché denaturato Sensibilità: 0.5-10 μg/ml Retta di taratura con BSA (Albumina di Siero Bovino) Lunghezza d'onda: 750 nm

22 Il metodo Bradford Questo metodo è molto popolare perchè semplice, rapido, economico e sensibile. Esso si basa sull'azione del Coomassie brilliant blue G-250 (CBBG) che si lega specificatamente a residui di arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina. Da notare che agisce primariamente con i residui di arginina ( 8 volte più che con gli altri residui elencati). Il CBBG si lega a questi residui in una forma anionica, con assorbanza massima a 595 nm. Il colorante nella soluzione madre si trova infatti in forma cationica che ha un massimo di assorbanza a 470 nm. Protein Determination

23 The Bradford Assay Add Dye Reagent Mix and wait 5+ minutes Read A 595 No protein Low protein High protein Protein sample

24 metodo di Bradford Principio: Il colorante Coomasie Blue forma composti colorati in "blu" con le proteine, tramite legami elettrostatici proteina-gruppi sulfonici del colorante in soluzione acida. Vantaggi: rapidità (5 minuti), sensibilità Svantaggi: qualche variabilità fra proteine diverse, campione non recuperabile perché denaturato. Sensibilità: 2-20 μg/ml Retta di taratura: con BSA Lunghezza d'onda: 595 nm

25 Protein Determination The BCA (Bicinchoninic Acid) Method Uses a similar principle as that described in the biuret reaction except that BCA is included and sensitivity is increased. Pierce Protein Assay Technical Handbook, 1999 This process is a two-step reaction. Protein + Cu 2+ + OH - Cu 1+ Cu 1+ + 2 BCA Cu 1+ /BCA chromophore (562 nm).

26 Using Standard Curve Protein (  g) A 750 33 92 0.200 0.550 Protein unknowns:

27 Una parte cruciale di questo saggio è il bianco. Dal momento che il saggio non risponde linearmente è molto importante "bloccare" il punto zero. Dal momento che questo punto è molto importante per la curva è fortemente raccomandato che vengano eseguiti almeno due bianchi. La scelta dello standard per questo tipo di saggio è cruciale per il suo successo. Molti ricercatori hanno notato anormalità utilizzando diversi standard con questo metodo. la BSA è stato lo standard originale ed è quello che usualmente si trova con l'acquisto dei vari kit. Tuttavia, è stato notato che la BSA piuttosto che una risposta "normale" dà un'altra risposta e potrebbe non sempre essere affidabile. Svariati ricercatori tendono perciò ad usare l'immunoglobulina G (IgG) come standard. Il CBBG si lega alle cuvette di quarzo abbastanza fortemente. Di conseguenza, dovrebbero essere utilizzate le cuvette di vetro o plastica.

28

29

30

31

32