Next Generation Sequencing (NGS) Illumina HiSeq 2000: 150 milioni di frammenti di 100 bp in una settimana. 1)Assemblaggio di genomi de novo 2)Analisi della.

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1 Next Generation Sequencing (NGS) Illumina HiSeq 2000: 150 milioni di frammenti di 100 bp in una settimana. 1)Assemblaggio di genomi de novo 2)Analisi della cromatina ( Chip-Seq ) 3)Analisi del trascrittoma (RNA-Seq ) 4)Analisi dello stato di metilazione (Bisulfite-Seq, RRBS, MeDIP-Seq) ….

2 Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq) L’immunoprecipitazione della cromatina è una tecnica che permette di identificare il sito di legame di una proteina (fattore di trascrizione, istone modificato, RNA polimerasi..) al DNA.

3 1) Le cellule sono trattate con la formaldeide che stabilizza il legame tra le proteine ed il DNA (Crosslinking ) In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

4 2) Le cellule sono lisate e la cromatina è sottoposta a sonicazione. In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

5 3) Vengono aggiunti anticorpi specifici contro la proteina di interesse che portano legate sferette magnetiche (beads), dopo che è avvenuto il legame anticorpo- proteina si centrifuga in modo da effettuare un processo di immunoselezione. In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

6 4) Infine si purificano i frammenti di DNA. In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

7 Input: Frammenti di DNA Output: File con le sequenze in formato FASTQ In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

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12 File FASTQ Ciascuna sequenza è identificata da 4 righe: -La prima riga comincia con il simbolo @ a cui segue il nome della sequenza -La seconda riga presenta il vero e proprio codice della sequenza -La terza riga comincia con il simbolo + ed è seguita da commenti opzionali -La quarta ed ultima riga contiene simboli che corrispondono a valori i che rappresentano la qualità di ciascuna base sovrastante. Esistono diverse codifiche e dipendono dal sequenziatore utilizzato. Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

13 Le sequenze devono essere mappate sul genoma utilizzando programmi di allineamento quali Bowtie. Sequenze+GenomaCoordinate genomiche Bowtie Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq) 1) MAPPING

14 Bisogna trovare le regioni arricchite di sequenze con programmi quali MACS. Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq) 2) Peak finding

15 In definitiva le sequenze (reads) selezionate sono quelle che sul genoma venivano riconosciute e legate dalla proteina di interesse. Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)