Laboratorio n° 5: Inoculo di Patogeni tellurici. Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Importanza dei patogeni tellurici 1.2. Sintomi dei patogeni.

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1 Laboratorio n° 5: Inoculo di Patogeni tellurici

2 Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Importanza dei patogeni tellurici 1.2. Sintomi dei patogeni tellurici 1.3. Tecniche di inoculo di patogeni tellurici 1.4. I patogeni oggetto della lezione: Fusarium oxysporum f.sp. basilici (FOB), Sclerotium cepivorum (SC), Pythium ultimum (PU) Attività di laboratorio 3.1. Selezione e preparazione dei campioni vegetali 3.2. Preparazione delle sospensioni di spore fungine (FOB) 3.3. Preparazione dell’inoculo di SC e PU 3.4. Inoculo con FOB 3.5. Inoculo con SC 3.6. Inoculo con PU

3 L’importanza dei funghi fitopatogeni tellurici  I funghi (es. Fusarium, Verticillium, Rhizoctonia) e gli oomiceti (es. Pythium, Phytophthora) fitopatogeni tellurici sono fra i fattori che maggiormente limitano la produttività degli agro-ecosistemi  Coltura protetta  Orto-floro vivaismo  Pieno campo

4 Verticillium dahliae – Cynara scolymus

5 Pythium spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp. - Lactuca sativa – Eruca spp. ecc

6 Il controllo dei funghi fitopatogeni tellurici  Messa al bando del Bromuro di Metile  Alternative al bromuro: Altri fumiganti (Dazomet, Metham sodio e potassio ecc.) Solarizzazione Utilizzo di microrganismi antagonisti (Trichoderma spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. ecc.)

7 Le spore possono essere utilizzate a fini sperimentali per riprodurre l’inoculo di un determinato fungo in condizioni controllate e con un potenziale di inoculo noto. Oltre alle spore possono essere utilizzati per l’inoculo anche: - Micelio fungino - Tasselli di substrato agarizzato colonizzato dai funghi - Substrati vari (semi di miglio, frumento, riso ecc) colonizzati dai patogeni Inoculo artificiale di funghi fitopatogeni terricoli

8 Inoculo artificiale di funghi fitopatogeni terricoli: SC TIPI DI INOCULO: 1_Sclerozi Le piante attaccate mostrano sintomi fogliari aspecifici come ingiallimenti e ridotta crescita mentre sul bulbo di rilevano marcimu molli e presenza di micelio bianco SC è l’agente causale del marciume basale dell’aglio e della cipolla. Produce sclerozi, i quali rispondono a stimoli specifici, che ne permettono la sopravvivenza nel suolo per lunghi periodi (>20 anni). Sclerotium cepivorum patogeno terricolo che attacca diverse specie del genere Allium

9 A B D C

10 Inoculo artificiale di funghi fitopatogeni terricoli: FOB Produce vari tipi di spore: micro- e macroconidi oltre che clamidospore di resistenza. TIPI DI INOCULO: 1_Spore al suolo (10 ml / vaso alla concentrazione di 1x10 6 e 1x10 5 spore ml -1 ) Le piante attaccate mostrano sintomi fogliari aspecifici come appassimenti e ridotta crescita oltre ad inbrunimenti del fusto e marcime a livello radicale Fusarium oxysporum f. sp. basilici (FOB) agente causale della fusariuosi del basilico

11 Inoculo artificiale di funghi fitopatogeni terricoli: PU Al genere Pythium spp. appartengono patogeni specialisti dei tessuti giovani, immaturi o compromessi (semi e plantule nelle prime fasi di sviluppo) Al genere Pythium spp. appartengono patogeni specialisti dei tessuti giovani, immaturi o compromessi (semi e plantule nelle prime fasi di sviluppo) Questi patogeni, come ad esempio Pythium ultimum, sono altamente polifaghi ed attaccano un gran numero di specie. Questi patogeni, come ad esempio Pythium ultimum, sono altamente polifaghi ed attaccano un gran numero di specie. Notevoli danni nelle fasi di impianto soprattutto in coltura protetta e vivaio. Notevoli danni nelle fasi di impianto soprattutto in coltura protetta e vivaio. la sintomatologia viene definita come “damping-off” o moria dei semi e delle plantule. la sintomatologia viene definita come “damping-off” o moria dei semi e delle plantule.

12 Basilico Pomodoro Lattuga Poinsettia Mais – Frumento

13 Pythium ultimum è caratterizzato da germinazione e crescita molto rapida (germinazione in 1-2 ore; colonizzazione dei semi e plantule anche in 6-12) e rapida crescita miceliare (10-20 mm giorno -1 Pythium ultimum è caratterizzato da germinazione e crescita molto rapida (germinazione in 1-2 ore; colonizzazione dei semi e plantule anche in 6-12) e rapida crescita miceliare (10-20 mm giorno -1 ) Risposta positiva della germinazione agli essudati dei semi e delle plantule. Tale risposta sembra aspecifica rispetto agli essudati (zuccheri, aminoacidi, acidi grassi) della pianta ospite Risposta positiva della germinazione agli essudati dei semi e delle plantule. Tale risposta sembra aspecifica rispetto agli essudati (zuccheri, aminoacidi, acidi grassi) della pianta ospite Sia i sintomi che i danni alle colture si manifestano in tempi molto rapidi a seguito della semina Sia i sintomi che i danni alle colture si manifestano in tempi molto rapidi a seguito della semina Utilizzeremo come inoculo un substrato agarizzato (PDA) colonizzato dal patogeno Utilizzeremo come inoculo un substrato agarizzato (PDA) colonizzato dal patogeno Inoculo di PU

14 Attività di laboratorio

15 Computo dei materiali e attività (gruppo PU) Piastre quadrate 12 x 12 (n° 12) Ogni piastra riempita con sabbia di quarzo (100 g) con due tesi: - inoculo PU (3 piastre) - inoculo PU + ammendamento con estratto di sulla sterile all’1% (5 ml piastra -1 ) (3 piastre) - controllo con acqua (3 piastre) - controllo + ammendamento con estratto di sulla sterile all’1% (5 ml piastra -1 ) (3 piastre) Inoculo con 4 tasselli (diametro 1 cm) di PU cresciuto su PDA per ogni piastra Semi di Medicago sativa (erba medica) (20 semi piastra -1 )

16 Vasi diametro 4 cm (n° 15) Piastre con FOB sporulato. Raccolta in acqua delle spore. Conta e diluizioni fino ad ottenere sospensione di spore alle concentrazioni di 1 x 10 6 e 1 x 10 5 ml. Computo dei materiali e attività (gruppo FOB) Ogni vaso riempito con sabbia di quarzo con due tesi: - inoculo FOB alta concentrazione (5 vasi) - inoculo FOB bassa concentrazione (5 vasi) - controllo con acqua (5 vasi) Inoculo con 5 ml vaso -1 delle sospensioni fungine Semi di Ocimum basilicum (basilico) (12 semi vaso -1 )

17 Esperiemnto in vaso: 9 vasi da 4 cm e9 vasi da 10 cm di diametro Piastre con SC con sclerozi. Raccolta degli sclerozi. Computo dei materiali e attività (gruppo SC) Ogni vaso riempito con sabbia di quarzo con tre tesi: - inoculo SC “alto” concentrazione (1 sclerozio g -1 suolo) (3+3 vasi) - inoculo SC “basso” (1 sclerozio 10 g -1 suolo) (3+3 vasi) - controllo (3+3 vasi) Impianto di bulbilli di Allium sativum (aglio) (3 bulbilli vaso -1 ) Impianto con piantine di Allium sativum (3 piantine vaso -1 )