L'elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche. SU GEL DI AGAROSIO.

Presentazione sul tema: "L'elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche. SU GEL DI AGAROSIO."— Transcript della presentazione:

1 L'elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche. SU GEL DI AGAROSIO SU GEL DI POLIACRILAMMIDE

2 µ = V/E µ= Mobilità elettroforetica della molecola; V= Velocità di migrazione delle molecole; E= Potenziale elettrico applicato. V è direttamente proporzionale ad E, alla carica della molecola, e inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove. pI è compreso tra 3–10, la maggioranza ha pI <8 Quindi a pH=8 o pH>8, la maggior parte delle proteine hanno carica netta negativa, e migreranno all’anodo (elettrodo positivo) Quindi la separazione dipende dal pH della soluzione in cui gli aa sono disciolti

3 Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS Sodio dodecilsolfato (SDS) La proteina assume una forma linearizzata ed una carica negativa approssimativamente proporzionale alla sua massa.

4 La separazione dei complessi SDS-proteine (quando sottoposti ad un campo elettrico) avviene in base agli effetti di setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel. Le proteine più piccole si muovono rapidamente attraverso il gel, mentre quelle di dimensioni maggiori sono più rallentate, migrando di meno.

5 Nella SDS-PAGE si utilizza un gel discontinuo composto da: Stacking gel nel quale vengono formati i pozzetti in cui vengono depositati i campioni da analizzare; Running gel (gel di risoluzione) che è la matrice in grado di separare le singole macromolecole.

6 STACKING GEL (UPPER) H2O ACRIL/BIS ACRIL BUFFER (pH 6.8) APS TEMED RUNNING GEL (LOWER) H2O ACRIL/ BIS ACRIL BUFFER (ph 8.8) SDS 20% APS TEMED APS e TEMED catalizzano la decomposizione dello ione persolfato con la formazione del corrispondente radicale libero S 2 O 8 2- + e SO 4 2- + SO 4 2- R. + A RA. RA. + A RAA. RAA. + A RAAA. E così via Catalisi radicalica R. = radicale dello ione persolfato A = monomero di acrilammide

7 * APS è l’estere disolfato dell’acqua ossigenata - O 3 S-O-O-SO 3 e forma radicali liberi SO 4 - * TEMED è un’ammina terziaria che reagisce con questi radicali e forma radicali liberi, che a loro volta reagiscono con l’acrilammide.

8  PREPARAZIONE GEL;  ASSEMBLAGGIO CAMERETTA ELETTROFORETICA;  PREPARAZIONE CAMPIONI;  CARICAMENTO DEI MARKERS E DEI CAMPIONI;  AVVIO DELLA CORSA

9 MARKERS: miscele di proteine pre-colorate e di peso molecolare noto, capaci di indicare la migrazione di proteine di peso molecolare simile. In commercio sono disponibili diversi standard proteici che coprono un'ampia gamma di pesi molecolari (PM) diversi.

10 Rivelazione delle proteine su gel: La procedura più comune di rivelazione è la COLORAZIONE. In genere, dopo che le proteine sono state colorate, il gel viene fotografato o essiccato. I kit disponibili sul mercato per la colorazione e la quantificazione delle proteine totali su SDS-PAGE includono sistemi rapidi e più o meno sensibili a base di blu Coomassie, kit di colorazione argentica (silver staining), sistemi per colorazione reversibile con zinco o rame e coloranti fluorescenti.

11 Identificazione di una proteina di interesse in una miscela proteica totale mediante il riconoscimento da parte di specifici anticorpi. 1.SDS-PAGE 2.Trasferimento su nitrocellulosa 3.Incubazione con anticorpi specifici 4.Immunorivelazione

12 TRASFERIMENTO SU FILTRO DI NITROCELLULOSA Preparazione di un sandwich che contiene gel e nitrocellulosa; Sandwich immerso in un tampone di trasferimento in una camera con elettrodi; La corrente perpendicolare al gel trasferisce le proteine dal gel alla nitrocellulosa.

13 INCUBAZIONE CON ANTICORPI SPECIFICI Incubazione del blot con gelatina o latte o BSA; Lavaggi rapidi; Incubazione con anticorpi primari; Lavaggi; Incubazione con anticorpi secondari marcati in vario modo. Uno dei metodi più comuni è l’utilizzo di un anticorpo Ab II coniugato ad un enzima E, di solito si usa la Fosfatasi alcalina o la Perossidasi di rafano.

14 ENHANCED CHEMILUMINESCENCE L’enzima Perossidasi in presenza di H 2 O 2 e luminolo, ossida il luminolo e produce luce. La radiazione emessa viene catturata da una pellicola fotografica che si impressiona e registra precisamente la posizione della proteina di interesse. Il blot è incubato in una soluzione contenente i suoi substrati S. L’enzima E converte S in un prodotto colorato insolubile che precipita sulla nitrocellulosa. Luminolo + H 2 O 2 Luminolo ossidato + Fotone perossidasi

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17 Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano che può essere impiegato per seguire l’ereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero genealogico MARCATORE GENETICO

18 I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in una popolazione con una frequenza maggiore dell’1%. Quando la frequenza e' inferiore a tale valore arbitrario, si preferisce parlare di varianti genetiche rare, che in molti loci sono presenti in aggiunta ai polimorfismi POLIMORFISMO

19  Piccoli blocchi di ripetizioni in tandem, da 15-50 volte, semplici nella sequenza (1-6bp) e dispersi nel genoma.  Sono numerosi, con una densità media stimata intorno ad 1 STR ogni 30,000-10,000bp.  Il numero di ripetizioni varia frequentemente tra gli alleli portando ad un alto grado di polimorfismo. DNA Microsatellite o STR (Short Tandem Repeat)

20 VANTAGGI Tecnicamente gli STR, a confronto con altri marcatori,presentano il vantaggio di essere: 1.Numerosi 2.Equamente distribuiti in tutta la parte eucromatica del genoma 3.Altamente polimorfici e quindi informativi 4.Analizzabili facilmente tramite PCR

21 Questa relativa facilità di studio ha portato ad un rapido incremento del numero degli STR esaminati Catalogazione standard: es D12S324,dove 12 è il cromosoma sul quale il marker è localizzato e 324 è un codice identificativo ( Bennett P: Demystified...Microsatellites. J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53:177-183 )

22 ANALISI degli STR Attualmente si utilizzano tecniche di PCR (Polymerase Chain Reaction) I primers, progettati esterni alla sequenza ripetuta ed utilizzati per amplificare le sequenze dei microsatelliti, sono marcati covalentemente con differenti fluorofori Tali molecole assorbono l’energia fornita da un laser per poi riemetterla a lunghezze d’onda differenti specifiche per ciascun fluoroforo

23 Nella seguente tabella sono indicati: il tipo di STR, la localizzazione cromosomica, il core, gli intervalli (range) possibili delle dimensioni in bp dei singoli STR ed il tipo di fluorocromo coniugato ad ognuno di essi

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26 TEST DI PATERNITA’ permette di accertare se un presunto padre è di fatto il padre biologico del bambino/a. Il test si basa sul principio che ogni individuo eredita il proprio patrimonio genetico dai genitori, il 50% dal padre ed il 50% dalla madre, e consiste nel confrontare le caratteristiche genetiche del figlio con quelle del presunto padre e della madre. Il padre presunto, per essere considerato padre biologico, dovrà possedere metà del profilo genetico presente nel figlio.

27 La prima fase del test di paternità consiste nell'ESTRAZIONE DEL DNA dai campioni biologici prelevati per l'esame e viene eseguita mediante l'impiego di protocolli riconosciuti ed approvati in ambito scientifico. Alcune volte non è possibile ottenere un campione di DNA utilizzando campioni standard di saliva. Poiché il DNA è uguale in ogni cellula di un individuo, il materiale genetico utilizzabile per effettuare il test può anche derivare da campioni cosiddetti "nonstandard."

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29 . Se il profilo genetico del figlio e del padre presunto differiscono per due o più caratteristiche genetiche l' ESCLUSIONE è certa (0% di probabilità di essere il padre biologico). Nel marcatore D21S11, il figlio ha un allele 29 ereditato dalla madre e un allele 30. Il presunto padre non presenta l’allele 30, quindi, IL RISULTATO E’ INCOMPATIBILE CON UN RAPPORTO DI PATERNITA’. Se si trovano più di due incompatibilità, la paternità viene ESCLUSA.

30 Se il profilo genetico del figlio e del padre presunto concordano per ogni caratteristica genetica analizzata, si ottiene un' ATTRIBUZIONE della paternità. In quest'ultimo caso, viene effettuata un'analisi statistica dei risultati ed infine viene fornita una percentuale di attribuzione che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni del DNA analizzateanalisi statistica dei risultati La probabilità finale di paternità non potrà mai raggiungere il 100%. E’ accettato dalla giurisprudenza italiana che la paternità è da considerarsi come «praticamente certa» quando la probabilità di paternità supera il valore del 99,72%.

31 DETERMINAZIONE DEL PROFILO GENETICO La determinazione del profilo genetico di un individuo comporta la genotipizzazione di 16 regioni del DNA (loci) altamente polimorfiche in lunghezza, variabili da individuo ad individuo, conosciute come regioni Microsatelliti o STR(Short Tandem Repeat).16 regioni del DNA (loci) altamente polimorfiche

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34 I PROFILI GENETICI CONDIVIDONO IL 50% DELLE REGIONI DI DNA ANALIZZATE

35 I PROFILI GENETICI PRESENTANO INCOMPATIBILITA’, ESCLUDENDO UNA POSSIBILE RELAZIONE PADRE-FIGLIO