BIOSINTESI E CONTROLLO DELLE MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI.

Presentazione sul tema: "BIOSINTESI E CONTROLLO DELLE MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI."— Transcript della presentazione:

1 BIOSINTESI E CONTROLLO DELLE MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI

2 Post-harvest OTAPREV Ochratoxin Prevention in Wheat FP6 OCHRATOXIN A RISK ASSESSMENT FP5 BIOCOP Screening for contaminants in food FP6 SAFE ORGANIC VEGETABLES The Carrot Alternaria Toxin Model FP5 CONTROL MYCOTOX FOOD Mycotoxin prevention in cereals FP5 Novel Integrated Strategies for Worldwide Mycotoxin Reduction in Food and Feed Chains Pre-harvest RAMFIC Fusarium Risk Assessment Models FP5 RAFBCA Risk Assessment of Fungal Biological Control Agents FP5 2E-BCAs in Crops Enhancement of Biocontrol Agents FP6 FUCOMYR Fusarium Resistant and Toxin Free Wheat FP5 WINE-OCHRA-RISK Ochratoxin risk Assessment and Management FP5 Pre-harvest RAMFIC Fusarium Risk Assessment Models FP5 RAFBCA Risk Assessment of Fungal Biological Control Agents FP5 2E-BCAs in Crops Enhancement of Biocontrol Agents FP6 FUCOMYR Fusarium Resistant and Toxin Free Wheat FP5 WINE-OCHRA-RISK Ochratoxin risk Assessment and Management FP5 Dissemination MONIQA Harmonizing methods in the food chain FP6 COST 835 Network on mycotoxin and toxigenic fungi FP5 EMAN European Mycotoxin Awareness Network FP5 MYCONET EU Network for identification emerging mycotoxin in wheat chain FP6 MYCOGLOBE Integration research on mycotoxins and toxigenic fungi FP6 Horizontal technologies GOODFOOD Quality monitoring in the food chain FP6 DETOX- FUNGI Toxigenic fungi detection FP5 MYCOTOX INCO-DEV Mycotoxin Control in Latin American South cone FP5 CONffIDENCE Inexpensive detection of Contaminants in the food chain FP7 MYCOSENSE Novel kit for rapid Mycotoxin Detection in food FP5

3 La crescita di microfunghi (muffe) provoca diverse alterazioni del substrato Nelle derrate alimentari: odori sgradevoli causati da diversi enzimi quali lipasi, proteasi ecc., alterazione del colore Una delle più importanti alterazioni è la formazione di MICOTOSSINE

4 Alcune specie fungine contaminano le derrate in campo, altre durante lo stoccaggio Funghi di campo Fusarium culmorum F. graminearum F. avenaceum Alternaria alternata A.infectoria Cladosporium herbarum Claviceps purpurea Funghi di stoccaggio P. cyclopium P.freii P. hordeii P. polonicum P. verrucosum P. aurantiogriseum P. viridicatum Aspergillus flavus, A.parasiticus Eurotium sp.

5 A. parasiticus A. carbonarius Penicillium verrucosum A. ochraceus P. expansum

6 Micotossine Metaboliti secondari prodotti da alcuni generi fungini (Aspergillus, Penicillium, Fusarium per es.) tossici in basse concentrazioni per i vertebrati (Samson, 1996) Il ruolo ecologico di molte di esse è ancora poco chiaro

7 Le micotossine possono avere un effetto dannoso a breve e/o a lungo termine sulle strutture cellulari e quindi sugli organi e sugli apparati Tra gli effetti tossici più importanti figurano: l’induzione di alcuni tipi di tumore l’indebolimento del sistema immunitario Si calcola che il 40% dei decessi nei paesi in via di sviluppo può essere collegato al consumo di derrate contaminate da micotossine

8 Una derrata può essere contaminata da più specie fungine con presenza simultanea di diverse micotossine L’effetto cumulativo può essere diverso da quello osservato per ciascuna tossina singolarmente

9 Alcune micotossine possono essere prodotte da specie diverse appartenenti allo stesso genere: AFLATOSSINE Aspergillus flavus, A. parasiticus OCRATOSSINA A Aspergillus ochraceus, A. carbonarius Penicillium verrucosum P. griseofulvum PATULINA GRISEOFULVINA ACIDO CICLOPIAZONICO ROQUEFORTINA C Una singola specie fungina può produrre diverse micotossine Altre vengono prodotte da funghi appartenenti a diversi generi

10 Le micotossine sintetizzate dai funghi tossigeni vengono normalmente rilasciate all’esterno del micelio fungino e si ritrovano nell’alimento contaminato A causa della loro persistenza queste possono diffondersi indipendentemente dall’organismo fungino che le ha sintetizzate Dopo essere state sintetizzate, le micotossine normalmente rimangono nella derrata anche durante l’immagazzinamento e il processing

11 Piante o loro prodotti (semi) Ci sono diversi punti critici per l’ingresso di infezioni fungine e quindi per una possibile contaminazione da micotossine in una catena alimentare tipo: Infezione fungina Sintesi di micotossine Consumo da parte dell’uomo e degli animali Micotossicosi primarie Consumo da parte di animali allevati Presenza nei tessuti Prodotti carnei Consumo da parte dell’uomo Secrezione con il latte Formaggi Micotossicosi secondarie

12 Nelle matrici liquide la diffusione di micotossine è veloce e non lascia nessuna parte della derrata incontaminata Nelle matrici solide la diffusione è più lenta e non omogenea: “contaminazione a spot”

13 Contaminazione non omogenea Il campionamento offre particolari difficoltà Distribuzione non omogenea Distribuzione omogenea

14 Principali micotossine presenti negli alimenti DON T-2 ZEA OTA AFB1 AFM1 FB1

15 Le aflatossine Problema mondiale, contaminazione in campo e/o nel post raccolta Presente in molte derrate alimentari (semi oleosi, mais, frutta secca, caffè) e mangimi Negli ultimi 40 anni sono stati effettuati numerosi studi sulla sintesi di aflatossine Oggi si conosce l’intero cluster genico che presiede la loro sintesi, anche se la regolazione della sua espressione non è stata completamente compresa

16 Le aflatossine – meccanismo d'azione Dopo l’ingestione, l'AFB1 viene attivata dal citocromo P450 formando un epossido in grado di legarsi alle basi puriniche, inducendo in questo modo genotossicità e citotossicità Cancerogeno per gli animali e l’uomo, organo target: fegato Limite UE: Cereali e loro prodotti destinati al consumo umano: 2 µg/Kg (Solo B 1 ); 4 µg/Kg (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ).

17 Ocratossina A Prodotta da alcune specie di Aspergillus e Penicillium Rilevata in semi di mais, orzo, grano, in diversi paesi Europei e in USA Rilevata anche nella birra e nel vino La crescita di Aspergillus tossigeni sembra legata alle condizioni di alta umidità e temperatura Alcune specie di Penicillium si sviluppano però anche a basse temperature (5°C)

18 Inibitore competitivo della sintesi proteica attraverso la soppressione della fenilalanina RNA sintetasi Incrementa la perossidazione lipidica. Nefrotossico, incluso nella lista di composti potenzialmente cancerogeni Limite UE: Cereali grezzi: 5 µg/Kg.

19 Fumonisine Prodotte da diverse specie di Fusarium La Fumonisina B 1 è la più frequente e la più tossica Possono causare la leukoencephalomalacia (gravi danni cerebrali) nei cavalli

20 Queste molecole inibiscono la sintesi degli sfingolipidi attraverso l’inibizione dell’enzima ceramide sintetasi. Questa attività porta all’accumulo di alcuni precursori tossici degli sfingolipidi: le sfinganine. Le Fumonisine possono inoltre indurre perossidazione lipidica e alterazioni nel DNA Limite UE: Mais grezzo : 2000 µg/Kg

21 Tricoteceni Gruppo di composti chimici correlato, prodotto da alcuni Fusarium spp, Cephalosporium spp e Trichoderma spp Inibitori della sintesi proteica La più diffusa, e meno tossica, è la vomitossina (DON) che comunque induce emorragie nel tratto digerente

22 Deossinivalenolo Prodotta da alcune specie di Fusarium durante l'interazione con l'ospite (e.g. F. graminearum - FHB in grano) Il loro meccanismo d'azione si basa sull'inibizione della sintesi proteica possono causare necrosi ed emorragie in tutto il tratto digestivo, riduzione dei processi rigenerativi del sangue, del midollo e della milza ed inoltre mutazioni agli organi riproduttivi Limite UE: Pasta secca: 750 µg/Kg;

23 Tossina T2 La tossina T-2 considerata responsabile di Aleukia alimentare che in Russia tra il 1942 e 1947 provocò la morte di 100.000 persone Malattia caratterizzata da macchie sulla pelle, emorragie interne multiple, consumo di midollo osseo Limite UE: under way...;

24 Zearalenone Metabolita secondario prodotto da diverse specie di Fusarium Contaminante di vari cereali in particolare mais Micoestrogeno capace di legare i recettori cellulari in luogo dell’estrogeno provocando così una sintomatologia tipica negli animali da allevamento (sterilità e ridotta produzione di latte) Limite UE: Cereali grezzi diversi dal mais: 100 µg/Kg

25 Patulina Prodotta da alcune specie di Aspergillus e Penicillium che crescono sui frutti e si ritrovano nei succhi di frutta (in particolare succo di mela) Ha proprietà antibiotiche Causa emorragie cerebrali, gastriche e polmonari Sospetto cancerogeno Limite UE: Succo di frutta 50µg/Kg

26 Perché i funghi producono le micotossine? Via di detossificazione da specie ossidanti accumulate durante la fase di ageing – es. le aflatossine sono formate mediante 6 passaggi di ossidazione (Narasaiah et al., 2006) Competizione (antibiosi) con altri competitori di nicchia – es. le aflatossine inibiscono la crescita di molti insetti allo stadio larvale (Miller, 1974)

27 Fattori che modulano la sintesi delle micotossine Fattori ambientali – Umidità, T – Disponibilità di risorse nutritive – Stress ossidativo Interazione con l’ospite – Mascheramento – Cross-talk ossilipinico

28 Lo stress ossidativo regola la produzione di diverse micotossine Diversi oxidant stressors aggiunti esogenamente quali perossido d'idrogeno, PUFA ossidati, epossidi, aldeidi, chetoni, ergosterolo perossidato, tetracloruro di carbonio e altri alogenometani inducono la biosintesi di alcune micotossine tra cui: Aflatossine (Fabbri et al., 1983) Ocratossina A (Reverberi et al., 2009) Deossinivalenolo (Ponts et al., 2004) Patulina (Castoria et al., 2005)

29 …come? Un caso di studio: le aflatossine L'invecchiamento cellulare (cell ageing) induce uno stato iperossidante nella cellula fungina che porta al differenziamento e all'attivazione del metabolismo secondario (Aguirre et al., 2007) La diminuzione delle difese antiossidanti nella cellula fungina genera un ambiente ossidativo che favorisce la produzione di aflatossine (Reverberi et al., 2007) Questo è stato verificato mediante la delezione del gene ApyapA che in A. parasiticus codifica un fattore di trascrizione capace di controllare la risposta antiossidativa (Reverberi et al., 2008)

30 OXIDATIVE STIMULUS yap1 CRM1 SH TGACTCAnGAAn Cu, Zn-Sod, Mn-Sod, Cat, Gst, Gpx O2-·O2-· OH · LOO · Nucleo Hyper-OXIDATIVE STRESS TGACTCAaflR box AFTX gene cluster Skn7 aflR SH Hsf2 yap1

31 Interazione con l'ospite Le condizioni di crescita in un ambiente ossidante si sviluppano anche nell'ambiente di interazione tra pianta e patogeno (Lamb e Dixon, 1994) Tali condizioni si presentano non solo durante l'interazione tra patogeni fungini “da campo” (e.g. Fusarium) ma anche nelle cosiddette patologie del post- harvest (Fanelli et al., 1984; Tsitsigiannis and Keller, 2005) Pianta e patogeno “comunicano” anche attraverso dei messageri secondari la cui porduzione è stimolata dallo stress ossidativo presente nell'ambiente di interazione: le ossilipine

32 Le pathways di biosintesi delle ossilipine le ossilipine nelle piante derivano dal C18:2, C18:3 e C16:3 e nei funghi dal C18:1-2 e 3 Nei funghi i primi enzimi descritti, coinvolti nella biosintesi delle ossilipine, mostrano delle omologie con le prostaglandina H sintasi dei mammiferi o con le COX La presenza di LOX e GST (enzimi coinvolti nella formazione delle PG e degli steroidi nei mammiferi) nei funghi indica l’esistenza di altre vie potenziali per la biosintesi di ossilipine (3 mesi fa è stato clonato un gene della LOX in Aspergillus)

33 Le Ossilipine modulano lo sviluppo e la biosintesi di micotossine Regolano la biosintesi di alcune micotossine (Burow et al., 1997; 2000) Sono coinvolte nell’interazione pianta-patogeno (Prost et al., 2005; Reverberi et al., 2009) LOX

34 Produzione di aflatossine da parte di A. parasiticus su sementi

35 Le ossilipine vegetali, probabilmente imitando quelle fungine, sono capaci di regolare la sintesi delle tossine (Gao et al., 2009; Reverberi et al., 2009) In particolare il 9-HPODE della pianta stimola la sintesi delle tossine mentre il 13-HPODE la inibisce (Burow et al., 1997) Alcune micotossine (e.g. FB1) sono capaci di stimolare le difese della pianta, ad esempio inducendo, attraverso il SA e l’JA, le PR proteins (i.e. PR1)(Asai et al., 2000)

36 Strategie di prevenzione Utilizzo di composti antiossidanti (Fanelli et al., 1984) Utilizzo di composti bioattivi di origine fungina pro-antiossidanti (Reverberi et al., 2005; Zjalic et al., 2006) Utilizzo di lieviti antagonisti resistenti allo stress ossidativo (Castoria et al., 2005; Tolaini et al., 2009)

37 Composti antiossidanti Composti ad azione antiossidante e/o antimicrobica inibiscono alcune micotossine (aflatossine, ocratossina A, zearalenone, fumonisina B1) in semi di grano e mais

38 Lotta Biologica – composti bioattivi da Basidiomiceti In oriente la medicina tradizionale utilizza sia funghi basidiomiceti che piante medicinali Quasi ad ogni specie è stato attribuito qualche potere curativo Dal 1960 anche la scienza ufficiale effettua ricerche in questo settore Individuati molti composti con azione farmacologica, spesso antiossidante

39 Trametes versicolorLentinula edodes Lentinano–  1-4 glucomannano Ep3–piccola molecola di lignina (stimola sistema immunitario) Tioprolina–aminoacido (antiossidante) PSK – glicoproteina (antiossidante, stimola il sistema immunitario, antivirale) PSP – glicoproteina (antitumorale, stimola il sistema immunitario)

40 Polisaccaridi fungini Studio dell’azione di filtrati colturali (LF) ed estratti miceliari di alcuni basidiomiceti sulla biosintesi di aflatossine

41 Qual'è il meccanismo di inibizione? I composti bioattivi presenti nel filtrato colturale di T. versicolor e L. edodes stimolano l'attivazione del sistema antiossidante del fungo micotossigeno Questo fa diminuire la presenza delle specie reattive (e.g. LOOH) nella cellula fungina La riduzione dello stress ossidativo, come detto in precedenza, “blocca” il metabolismo secondario, cioè la sintesi di micotossine

42 Agenti di biocontrollo LIEVITI Cryptococcus laurentii e Rhodotorula glutinis resistono allo stress ossidativo colonizzano tessuti di mela nelle fasi iniziali di deterioramento BIOCONTROLLO: competizione per spazio e nutrienti BASIDIOMICETI EDULI Lentinula edodes, Trametes versicolor, Auricularia auricula-judae attività antiossidante di per sé, inoltre stimolano la risposta antiossidante dell’ospite producono sostanze ad attività antimicrobica e con proprietà farmacologiche BIOCONTROLLO: produzione β-glucani e glicoproteine

43 Saggio in vivo di LF 23 e LS28 sul marciume in mela ferita ed inoculata con P. expansum P.exp+LF 23 P.exp+LS28 P.expansum P.exp+LS28+LF 23 T=136 ore 0,00022P.exp+LS28+LF23 0,00037P.exp+LF23 0,00030P.exp+LS28 0,00043P.exp abs 440 nm/mg tessutoCAMPIONE

44 MATERIALI E METODI Quantizzazione patulina mediante HPLC Saggiate tre ferite per ogni tempo di analisi Effetto di LF 23 e LS28 su sintesi patulina in vivo in presenza di P. expansum Riduzione > 98% 0.1 ng 0.04 ng 2.91 ng 1.53 ng

45 conclusioni Lo stress ossidativo e le ossilipine modulano la biosintesi di alcune micotossine. L'uso di antiossidanti o di composti che stimolano il sistema antiossidante del fungo possono rappresentare una strategia comune nell'inibire la sintesi di più tossine contemporaneamente