OR e CD OR Rotazione ottica (potere ottico rotatorio) -Misura la quantità di rotazione ad una lunghezza d’onda fissa CD circular dichroism -Misura la differenza.

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1 OR e CD OR Rotazione ottica (potere ottico rotatorio) -Misura la quantità di rotazione ad una lunghezza d’onda fissa CD circular dichroism -Misura la differenza di assorbimento della luce polarizzata circolarmente a destra da quella polarizzata a sinistra a differenti lunghezze d’onda

2 Sorgente luminosa luce non polarizzata Filtro polarizzatore Piano della luce polarizzata Luce polarizzata: Luce che vibra in un solo piano (il vettore campo elettrico) L’attività ottica

3 Polarimetro Sorgente luminosa Filtro polarizzatore Piano della luce polarizzata Tubo contenente il campione Filtro ruotante Consente di stabilire la rotazione del piano della luce polarizzata Composto otticamente attivo Un enantiomero è un composto otticamente attivo

4 Il Polarimetro e il potere ottico rotatorio

5 Le Proteine e gli acidi Nucleici sono molecole chirali Perché tutti gli amminoacidi (escluso glicina) sono chirali Perchè la forma della proteina costituisce una macrostruttura non sovrapponibile alla sua immagine speculare, quindi chirale Perciò tutte le proteine hanno una chiralità intrinseca e interagiranno con la luce polarizzata

6 Monocromatore Elettro-ottici polarizzatore e rivelatore CampioneIl segnale rilevato va ad un elaboratore PC Lo strumento CD (Dicrografo)

7 Spettrometro CD, una immagine reale di uno strumento

8 Dicroismo circolare: il segnale rilevato Il Dicroismo circolare è la differenza tra la luce destra e sinistra circolarmente polarizzata ed è misurata in funzione della lunghezza d’onda La differenza tra l’assorbimento a destra e quello a sinistra dà il dicroismo circolare

9 Significato del CD e struttura molecolare Spettri CD di proteine o acidi nucleici con strutture secondarie differenti sono differenti Pertanto l’analisi di spettri CD dà importanti informazioni sulla struttura secondaria di queste molecole

10 La differenza di assorbanza A L -A R è molto piccola (generalmente do circa 0.0001 unità di assorbanza) Necessita di apparato di rivelazione molto sensibile ecco perché uno strumento CD è più costoso di uno UV/VIS Questa differenza si misura in ellitticità molare  r CD: unità di misura e sensibilità

11 La luce polarizzata La luce è un'onda elettromagnetica che consiste in un campo elettrico E ed un campo magnetico H oscillanti, che possono essere rappresentati da vettori perpendicolari tra loro, e perpendicolari alla direzione di propagazione. Il piano di polarizzazione è il piano su cui oscilla il campo elettrico E, ma poiché una sorgente di luce è di solito composta da un insieme di emettitori disposti in maniera casuale, la luce emessa è un insieme di onde con tutte le possibili orientazioni del vettore E. La luce polarizzata linearmente, invece, è una radiazione elettromagnetica in cui il vettore E oscilla in un solo ben preciso piano di polarizzazione. Può sembrare strano che la luce polarizzata possa essere considerata una radiazione asimmetrica, in grado di interagire con due enantiomeri in maniera differente. In realtà la direzione di propagazione della radiazione, quella del vettore elettrico E e quella del vettore magnetico H costituiscono una terna di vettori ortogonali non sovrapponibile alla sua immagine speculare.

12 La seguente animazione mostra come in una luce linearmente polarizzata il vettore campo elettrico oscilla lunga una e una sola direzione (quella z, nella figura) e perpendicolare all’asse di propagazione (quello x). Un osservatore situato sull’asse x vedrà il vettore campo elettrico raggiungere un massimo e poi diminuire fino a passare per lo zero, cambiare verso, raggiungere un minimo e poi ricrescere di nuovo. L’onda sinusoidale rimane sempre confinata nel piano xz e l’osservatore vedrebbe un vettore oscillare lungo z.

13 Quando due onde piano polarizzate sono presenti simultameamente in due piani perpendicalari, le proprietà dell’onda che ne risulta dipendono dall’intensità e dalle fasi delle due onde componenti. La seguente animazione mostra l’onda risultante dalla somma di due onde di stessa intensità, frequenza, lunghezza d’onda e in fase ma polarizzate secondo due piani perpendicalari (orizzontale per quella rossa e verticale per la verde) Il risultato della somma tra le due onde, è un’altra onda piano polarizzata (quella azzurra) con il piano di polarizzazione spostato di 45° rispetto ai piani di polarizzazione delle due onde originarie

14 Se le due onde non sono in fase (c’è una differenza di 90° tra le loro fasi) l’onda elettromagnetica che ne risulta è circolarmente polarizzata. In pratica il vettore campo elettrico E ruota con frequenza pari alla frequenza della radiazione: il risultato è che la punta del vettore percorre una traiettoria a spirale. L’onda si propaga quindi come una funzione che descrive una traiettoria a spirale e non più sinusoidale Se l’osservatore si pone lungo l’asse di propagazione.

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16 Cosa succede quando due onde circolarmente polarizzate sono sommate? Se le due onde hanno la stessa intensità, frequenza e lunghezza d’onda ma sono rispettivamente circolarmente polarizzate destra e sinistra la luce che ne risulterà sarà linearmente polarizzata. Una radiazione polarizzata linearmente va vista come la somma di due onde polarizzate circolarmente, una sinistrorsa e una destrorsa.

17 Cosa succede quando una radiazione elettromagnetica interagisce con la materia? parte della radiazione può essere assorbita Può variare la velocità della radiazione (tutti i materiali hanno un indice di rifrazione!!!)

18 Assorbimento Luce piano-polarizzata in un mezzo che l’assorbe ma non la rallenta. Come si può vedere varia solo l’intensità del vettore campo elettrico Luce circolarmente-polarizzata in un mezzo che l’assorbe ma non la rallenta. Anche in questo caso varia solo l’intensità del vettore campo elettrico

19 Luce polarizzata in un mezzo rifrangente Luce piano-polarizzata in un mezzo in grado di rallentarla. La luce che ne risulterà ha la stessa frequenza di quella incidente ma varierà nella lunghezza d’onda ( =c ) Stesso discorso per la luce circolarmente-polarizzata

20 Cosa succede se la materia assorbe preferenzialmente una delle due componenti (destra o sinistra) della luce linearmente polarizzata? Nella figura la le due componenti circolarmente polarizzate della luce linearmente polarizzata sono assorbite differentemente: la circolarmente polarizzata destra (rossa) non è assorbita mentre la circolarmente polarizzata sinistra (verde) è assorbita.

21 I vettori campo elettrico escono dal mezzo con intensità differenti e il vettore somma descrive una traiettoria ellittica. La luce è detta ellitticamente polarizzata.

22 Il dicroismo circolare è una tecnica di analisi strutturale simile alla spettrofotometria in quanto è basata sull'assorbimento da parte del campione di una radiazione UV o visibile. La differenza è che la radiazione usata in questo caso è polarizzata circolarmente, e quella che viene misurata è la differenza tra le assorbanze (  ) riscontrate usando come radiazioni incidenti radiazioni polarizzate circolarmente nei due possibili versi orario e antiorario. Il CD permette di trarre importanti informazioni su molecole chirali. Può essere usato per determinare la configurazione assoluta di una molecola, ma anche configurazioni relative e conformazioni. Il Dicroismo circolare

23 Lo spettro CD Un cromoforo chirale, ma anche un cromoforo non chirale che si trovi in un intorno chirale, può assorbire le luci polarizzate circolarmente destra e sinistra in maniera diversa, cioè con assorbanze A D ed A S (e quindi anche assorbanze specifiche molari  D ed  S ) diverse. Uno spettro CD è un grafico del dicroismo circolare,  A: o del dicroismo circolare molare,  :  R -  S in funzione della lunghezza d'onda. Uno spettro CD assomiglia quindi ad un normale spettro UV, ma DA e De possono anche assumere valori negativi. Naturalmente la relazione tra DA e Dε è ancora la legge di Lambert-Beer:  A = . l. d dove l è espresso in cm e c è la concentrazione molare.  A= A S -A D

24 In generale ogni transizione elettronica che dà origine ad un assorbimento UV/visibile dà anche origine ad una banda nello spettro CD, chiamata effetto Cotton, il cui massimo (o il minimo per bande con segno negativo) si trova più o meno alla stessa lunghezza d'onda del massimo di assorbimento UV/visibile. Lo spettro CD è dato dalla sovrapposizione di bande positive e negative di questo genere. Un esempio di spettro CD è mostrato in Figura. Come ci si può aspettare da considerazioni di simmetria, gli spettri CD di enantiomeri sono uguali, ma hanno segni opposti.

25 A volte il dicroismo circolare è espresso sotto forma di ellitticità molare. Se la radiazione incidente sul campione è polarizzata linearmente, all'uscita del campione le due componenti hanno intensità diverse e la radiazione diventa polarizzata ellitticamente. L'ellitticità  è definita come un angolo la cui tangente è uguale al rapporto tra l'asse minore ed asse maggiore dell'ellisse, e va da 0° per una luce polarizzata linearmente a 45° per una luce polarizzata circolarmente. tang  =b/a Tuttavia poiché la differenza di assorbanza è sempre molto piccola, anche l'angolo  assume sempre valori piccoli (si possono misurare ellitticità di 1/1000 di grado), ed è quindi approssimativamente proporzionale alla concentrazione. Si può allora definire una ellitticità molare [  ]: dove l è espresso in dm e c è la concentrazione decimolare, ossia espressa in moli per 100 ml (o dmol/l; si notino ancora una volta le insolite unità di misura). L'ellitticità molare [  ] è legata al dicroismo circolare molare dalla relazione:

26 L’ellitticità può essere convertita da radianti in gradi mediante: L’ellitticità molare [  ] è relazionata alla differenza tra i coefficienti  Δε [  ] = 3298Δε Ellitticità molare [  ] deg cm 2 mol -1

27 Lo spettrofotometro CD Si usa invece una radiazione polarizzata linearmente prodotta da una lampada a Xeno (a), molto potente (150-450 W). La radiazione passa poi attraverso il monocromatore (b), che seleziona la lunghezza d'onda desiderata, e attraverso il filtro polarizzatore (c), che la polarizza linearmente. Il cuore dello spettropolarimetro CD è il cosiddetto modulatore elettro-ottico (d), costituito da un cristallo capace di far passare alternativamente la componente destra o sinistra della luce polarizzata linearmente a seconda del campo elettrico a cui è sottoposto. Il modulatore elettro-ottico è sottoposto ad un campo elettrico alternato, per cui il campione (e) è attraversato alternativamente dalle componenti destra e sinistra. Se le due componenti sono assorbite in maniera diversa, il rivelatore (f) origina un segnale di intensità oscillante. L'ampiezza di questa oscillazione permette di misurare il dicroismo circolare.

28 Il CD è una tecnica molto usata per lo studio conformazionale di peptidi e proteine. Una catena polipeptidica è formata da tanti amino acidi legati attraverso il legame peptidico. L’unico cromoforo presente è quello associato al legame peptidico, cioè quello ammidico. Le due transizioni possibili sono la n  * a 210-230 nm e la  * a 180-200 nm. La prima non è permessa per simmetria e quindi è caratterizzata da valori di  molto piccoli (<100) mentre la seconda è più intensa. La struttura secondaria di una catena polipeptidica può essere fondamentalmente di 3 tipi:  -elica, foglietto  e  -turn. Gli spettri CD consentono di distinguere tra queste tre differenti conformazioni. CD di polipeptidi

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30 La conformazione ad  elica è la più comune in molte proteine soprattutto quelle globulari. Uno spettro CD di un polipeptide ad  -alica è tipicamente caratterizzato da una banda negativa a 222 nm dovuta alla transizione n-  * e da una banda negativa a 208 nm e una positiva a 198 nm relativa all’exciton coupling delle transizioni  * del peptide. [][]  elica

31 Le misure CD di polipeptidi con struttura secondaria di tipo  sono complicate dalla scarsa solubilità del peptide stesso nel solvente solitamente utilizzato per la misura e dalla possibilità che esistano catene parallele o anti parallele. In genere lo spettro CD mostra due assorbimenti uno positivo a 195 nm e uno negativo a 216 nm, di comparabile intensità. [][] A causa però della maggiore variabilità conformazionale della  struttura rispetto alla , i CD di polipeptidi a struttura  sono molto meno riproducibili di quelli relativi a peptidi a struttura secondaria  e dipendono fortemente dalla lunghezza della catena e dal solvente. Foglietto 

32 Le strutture secondarie definite  -turn sono quelle in cui la catena peptidica va incontro ad una inversione della sua direzione. Le strutture di questo tipo sono tipicamente presenti in polipeptidi ciclici ricchi di residui di prolina. Gli spettri CD di queste strutture secondarie sono molto meno informativi dei precedenti e possono essere a secondo dei casi simili a quelli dei peptidi a conformazione di foglietto pieghettato o ad  -elica  -turn

33 Notare il progressivo cambiamento a  222 con l’incrementare della struttura a elica —— chemotripsin (~tutta  ) —— lisozima (  &  ) —— triosefosfate isomerasi (perlopiù  e poco  ) —— mioglobina (  ) Il CD di una proteina dipende dalla sua struttura secondaria

34 34 100% di elica a 0 o C Diventa random coil aumentando la t Gli spettri CD dipendono dalle condizioni La temperatura è il parametro più critico

35 IInfluenza delle catene laterali EE’ chiaro che il cromoforo peptidico non è l’unico cromoforo presente in una proteina. Ci sono infatti le catene laterali degli amminoacidi aromatici (Phe, Try, Tyr) che mostrano i caratteristici assorbimenti del cromoforo benzenico tra 250 e 300 nm. LLa Phe mostra un picco di assorbimento intorno a 250 nm. La Tyr ha un gruppo fenolico che assorbe a 280 nm per il ben noto effetto auxocromo del gruppo OH. Un fattore caratteristico è ovviamente la dipendenza dal pH del valore del massimo di assorbimento. Infatti a pH basici si osserva un notevole effetto batocromico (295 nm). Il Trp ha il cromoforo indolico che è responsabile di spettri CD ancora più complessi, infatti sono presenti differenti transizioni nella zona tra 250-300 nm.

36 Un esempio sulle catene Peptidiche… Spettri molto differenti per una –  -elica –  - a pieghe (  sheet) –“random coil” (struttura disordinata) I contributi sono additivi –Si può determinare il contributo della struttura  elica, della  a pieghe e del “random coil” mediante misure CD del peptide in soluzione

37 Spettro CD Concentrazione della proteina: circa 0.5 mg/mL

38 Lo spettro del collagene Collagene destrutturato Collagene nativa (elica)

39 La struttura della subtilisina ottenuta da dati CD e calcoli al computer è in accordo con la struttura trovata da dati di diffrazione di raggi X La subtilisina è un enzima proteolitico 58% helix 26% sheet 16% coil