METODICHE DI IMMUNOCHIMICA

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1 METODICHE DI IMMUNOCHIMICA
permette la determinazione quantitativa di proteine in tessuti e omogenati METODI IMMUNOCHIMICI - ELISA (Enzyme-Linked Immunoassorbent Assay) - Western blot - Radioimmunotest - Immunoistochimica Immunoprecipitazione etc etc

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3 complesso antigene-anticorpo
METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di Affinità - Avidità selettività – specificità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse. quantificazione del complesso antigene-anticorpo complesso antigene-anticorpo campione + anticorpo

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6 SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI
Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). La tendenza dell’anticorpo a legare altre molecole, strutturalmente simili all’analita, viene quantificata attraverso la sua reattività crociata. Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici BaP 100% 40% posizione di coniugazione con la proteina carrier utilizzata per la sintesi dell’immunogeno

7 STRATEGIE DI SINTESI DELL’IMMUNOGENO
La scelta della posizione di funzionalizzazione usata per la sintesi dell’immunogeno permette di ottenere anticorpi per diverse applicazioni immunogeno immunogeno Anticorpo specifico per l’analita Anticorpo specifico per la classe

8 LA NASCITA DEI METODI IMMUNOMETRICI
1942. Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluoresceina . 1959. Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977. 1960. Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche. 1969. Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide. 1969. Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA). 1971. Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida.

9 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) ANALISI DIRETTA Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti) OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE ANALISI

10 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce

11 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno

12 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche - errori - precisione e accuratezza - tempi di esecuzione - rapidità

13 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI
Il legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, ka costanti di velocità di associazione del complesso kd costanti di velocità dissociazione del complesso

14 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI
Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = Keq è la costante di equilibrio o di affinità (espressa generalmente in L/mol) Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq = M-1

15 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI
Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd =

16 = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq
SCATCHARD PLOT (I) L’affinità dell’anticorpo per l’analita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard (VALE X 1 MOLECOLA x 1 Ab). Riprendendo l’equazione: Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene: [An-Ab]eq [An]eq = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

17 = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq
SCATCHARD PLOT (II) [An-Ab]eq [An]eq = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse x è Abt.

18 Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free)
rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse x è Abt.

19 Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq = 109-1012 M-1

20 EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO
SCATCHARD PLOT (IV) EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima. [An-Ab] [An-Ab]/[An] Retta 1 Retta 2 La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo: eterogeneità (differenza tra le due Keq); specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto).

21 SCATCHARD PLOT (III) High affinity Abt Low affinity

22 CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI
ANALITA: la molecola la cui concentrazione può essere misurata con un metodo immunometrico Analita può essere in due forme LIBERA o LEGATA complesso (Ag-Ab) metodi IMMUNOMETRICI vengono classificati sulla bse della natura del tracciante RADIOimmunimetrici ENZIMOimmunometrici FLUOROimmunometrici CHEMIO Immunometrici

23 CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI
COMPETITIVI Ovvero metodi «in difetto di anticorpi» NON COMPETITIVI Ovvero metodi «in eccesso di anticorpi» ETEROGENEI È necessaria la separazione (complesso Ab-Ag) per la rilevazione del segnale analitico OMOGENEI Non è richiesta la separazione fisica tra le due frazioni

24 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI
METODI COMPETITIVI La misura della quantità di analita (An) è basata sulla competizione con il tracciante (An*) per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). L’equilibrio che si instaura è: KAn An + Ab An-Ab Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i = costante [Ab]i < [An]i + [An*]i + An* KAn* An*-Ab

25 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI
Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

26 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione della lettura del campione incognito su di una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B0 in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. B0 è il segnale ottenuto in assenza di analita B è il segnale a concentrazione x di analita segnale concentrazione analita B/B0 log concentrazione analita

27 PARAMETRI QUANTITATIVI
Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard di B0 Sensibilità pendenza della curva Midrange Concentrazione corrispondente a B/B0 50% B/B0 log concentrazione analita Intervallo dinamico Convenzionalmente compreso fra B/B0 90% e B/B0 10%

28 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI “FITTING” DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE
y x b = fattore di pendenza(*) FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI x = dose y = B-N FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI a c a+d 2 y x d b = fattore di pendenza(*) L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N x = dose y = B (*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log

29 Modello logit-it logistico a “4 parametri”
ANALISI DEI DATI Curva di concentrazione/risposta (curva standard, di calibrazione, di taratura) : espressione grafica dell’andamento della risposta del saggio al variare della concentrazione dell’analita (standard) utilizzata come scala di calibrazione per interpolare le risposte relative ai campioni incogniti. Modello logit-it logistico a “4 parametri” Y = (a - d)/[1 + (x/c)b] + d a = valore asintotico del massimo (dose massima) b = pendenza del tratto rettilineo della sigmoide c = IC50, ovvero concentrazione dell’analita nel campione in grado di legare il 50% dell’anticorpo d = valore asintotico del minimo (dose 0)

30 PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE
SI ASSUME ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%) errori

31 EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI
B/B0 log concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione: Ridurre la concentrazione del tracciante Diminuire la quantità di anticorpo immobilizzato e riottimizzare il metodo (se la rivelabilità del tracciante è adeguatamente elevata, si sposta verso il basso il range dinamico) Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo e riottimizzare il metodo La rivelabilità assoluta del tracciante ha un effetto solo indiretto, permettendo di lavorare a concentrazioni minori.

32 SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
La specificità di un anticorpo è la sua capacità di discriminare tra antigeni con struttura simile. Tra i vari modi per misurare la specificità di un anticorpo, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto. 100 [An-Ab]/[An] 50 a b [An]

33 METODI COMPETITIVI OMOGENEI
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo.

34 METODI COMPETITIVI OMOGENEI
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) Sono stati proposti due sistemi. 1° sistema: Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

35 METODI COMPETITIVI OMOGENEI
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) 2° sistema: Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

36 METODI COMPETITIVI OMOGENEI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di movimento di circa ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 0,1-1 ns. In condizioni di eccitazione costanti l’emissione polarizzata sarà funzione delle dimensioni del fluoroforo e del rapporto tra tempo di rilassamento rotazionale e tempo di decadimento della fluorescenza. L’analita è marcato con una molecola fluorescente. Mediante misure di FP è possibile misurare la frazione di tracciante legato all’anticorpo in fase omogenea. Infatti il tracciante legato mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Perché ciò si verifichi, il tempo di decadimento della fluorescenza deve essere più lungo del tempo di rotazione del farmaco e più breve del tempo di rotazione del complesso antigene-anticorpo.

37 METODI IMMUNOMETRICI NON COMPETITIVI
Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei - Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) - successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag] L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*

38 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Antigene Enzima Incubazione Tracciante Anticorpo di rivelazione Aggiunta del tracciante Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

39 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

40 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

41 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

42 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

43 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

44 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

45 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva ideale è lineare. Segnale Concentrazione analita In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione. Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione

46 PARAMETRI QUANTITATIVI
Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard del bianco Segnale Sensibilità pendenza della curva concentrazione analita Intervallo dinamico

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48 EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI
B/B0 concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione: Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo (l’antigene viene catturato più efficacemente dell’anticorpo) Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa) ottimizzando le condizioni di rivelazione, utilizzando principi di rivelazione maggiormente sensibili o sistemi di rivelazione amplificati.

49 METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI
substrato prodotto intermedio prodotto finale Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale. In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc...

50 METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI
CARATTERISTICHE Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei

51 INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI
I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

52 TRACCIANTI An + Ab An-Ab
La formazione del complesso An-Ab non è in genere facilmente misurabile. Viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto (non viene infatti rivelato direttamente l’analita) introducendo un tracciante che partecipando alla reazione immunologica la evidenzia con alta rivelabilità. Il tracciante viene ottenuto legando un “label” opportuno (specie facilmente rivelabile con una opportuna tecnica analitica) all’antigene, ad un derivato dell’antigene o ad un anticorpo.

53 LABEL Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo.

54 -Enzimi LABEL - Isotopi radioattivi - Molecole fluorescenti
(125I, 3H) - Molecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) -Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti

55 La misura dell’attività enzimatica
viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

56 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

57 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Vantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

58 These enzymes are typically used because they each meet most, if not all, of the criteria necessary to produce a sensitive, inexpensive, and easily performed assay. These criteria include: ◗ stability at typical assay temperatures:4°C, 25°C, and 37°C, ◗ greater than six months shelf life when stored at 4°C, ◗ commercially available, ◗ capable of being conjugated to an antigen or antibody, ◗ inexpensive, ◗ easily measurable activity, ◗ high substrate turnover number, ◗ unaffected by biological components of the assay.

59 TRACCIANTI ENZIMATICI
SISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza

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61 Peroxidase is a small molecule (MW ~40,000) that can usually be conjugated to an antibody in a 4:1 ratio. Due to its small size, it rarely causes steric hindrance problems with antibody/antigen complexes bound on a surface Several substrates, yielding either soluble or insoluble reaction products, are commercially available for peroxidase. The three most common substrates that produce an insoluble product are TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidine), DAB (3,3',4,4' diaminobenzidine), 4CN (4-chloro-1-naphthol).

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63 Alkaline phosphatase is approximately double the size of peroxidase (MW ~86,000).
This means that one will typically see a lower enzyme to antibody conjugation ratio. It also means that the larger molecular size of alkaline phosphatase can cause steric hindrance issues due to close packed antigen-antibody complexes. The most common substrate that produces an insoluble reaction product is BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium). It is recognized as the most effective substrate for immunoblots due to its stability and resistance to fading when exposed to light. The most widely used substrate that produces a soluble reaction product is p-NPP (p-nitrophenylphosphate). It produces an intense yellow color measurable at 405 to 410 nm.

64 APPLICAZIONI: ESEMPI Le più comuni applicazioni dei metodi immunometrici in chimica analitica clinica riguardano la determinazione di: ormoni nei fluidi biologici (sangue, urina, saliva) farmaci nel siero e nelle urine (antiepilettici, antidepressivi, cardioattivi, immunosoppressivi, antibiotici, ecc...) droghe d’abuso nei fluidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi, cocaine) Immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari e IgD nel siero, proteine di derivazione tubulare e glomerulare nelle urine Interleuchine diagnosi di Helicobacter pylori, Herpes, Rubella, Brucella, Toxoplasma, Epatite

65 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay
Negativo Positivo Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida: Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) e fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dell’analita (T) e la zona di controllo (C)

66 LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY
DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura:    - da negativo a 20 mg/l    - da 20 a 50 mg/l    - da 50 a 100 mg/l    - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test:    - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l    - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l    - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l    - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza:    - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante    - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO Conformità direttiva 98/79/CEE

67 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter
In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

68 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: analizzatori automatici
Abbott TDx Laboratori di grosse dimensioni utilizzano analizzatori automatici che, una volta inserito il campione, eseguono automaticamente le procedure di calibrazione, analisi del campione ed elaborazione dei dati.