IMPIEGHI BIOTECNOLOGICI DI GENI MERISTEMATICI CNR - Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria (IBBA) – Sezione di Roma Laboratorio di Plant Functional.

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1 IMPIEGHI BIOTECNOLOGICI DI GENI MERISTEMATICI CNR - Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria (IBBA) – Sezione di Roma Laboratorio di Plant Functional Genomics (PFG) di Montelibretti

2 Sviluppo embrionale di una pianta superiore Nelle piante, durante l’embriogenesi, si formano due poli di accrescimento (meristema radicale e meristema apicale) che rimangono indeterminati per tutta la vita della pianta e mantengono la capacità di differenziare organi SAM RAM

3 IBBA - PFG Tutti gli organi aerei della pianta derivano dall’attività differenziativa del meristema apicale del germoglio (SAM = Shoot Apical Meristem) La radice principale si forma dalle cellule che costituiscono il meristema radicale (RAM = Root Apical Meristem)

4 Le piccole dimensioni del genoma (circa 157 Mbp, 5 cromosomi) la rendono utile per studi di mappatura genomica e per il sequenziamento; Le piccole dimensioni della pianta ne consentono la coltivazioni in spazi ristretti; Il suo rapido ciclo vitale (circa 6 settimane dalla germinazione alla prodzione di semi) consente di ottenere in tempi brevi le successive generazioni; L’autogamia consente di ridurre notevolmente la variabilità genetica; Sono stati messi a punto efficaci protocolli di trasformazione genetica Arabidopsis thaliana come sistema modello

5 IBBA - PFG Il SAM è diviso in 3 zone citologicamente differenti: la zona centrale (CZ), caratterizzata da cellule pluripotenti che si dividono lentamente e sono deputate al mantenimento della forma e taglia del meristema stesso; la una zona periferica (PZ), in cui le cellule si dividono rapidamente e danno origine a specifici primordi di organi laterali; la zona di accrescimento del sistema vascolare (RZ) in cui le divisioni cellulari sono rapide Meristema apicale di Arabidopsis thaliana

6 Oltre alla suddivisione in zone, le cellule del meristema apicale vegetativo sono divise in 3 popolazioni distinte, che costituiscono lo strato L1, L2 e L3 del meristema.

7 Pianta adulta di Arabidopsis. Nel corso della crescita vegetativa della pianta, il SAM produce meristemi secondari oltre alle foglie. Il meristema secondario che si forma alla giunzione tra il primordio fogliare e lo stelo, riproduce il comportamento del SAM producendo ramificazioni secondarie.

8 IBBA - PFG Meristema apicale durante vari stadi di sviluppo di Arabidopsis e schema della fillotassi (programma di organogenesi fogliare ordinato in cui le foglie si formano in posizioni prevedibili matematicamente)

9 GENI NECESSARI PER LA CORRETTA DIVISIONE CELLULARE IBBA - PFG

10 Geni meristematici importanti per il mantenimento e l’attività organogenetica del meristema apicale (geni per molecole segnale, CV, geni che codificano per fattori di trascrizione homeobox, WUS e KNOX, e di tipo NAC) STM KNAT1 CV1 WUS CV3 CUC1,2 ANT

11 HOMEODOMAINKNOX1KNOX2ELK MEINOX C-term N-term BASIC HELIX 1 LOOP HELIX 2 TURN HELIX 3 FATTORI DI TRASCRIZIONE DI TIPO KNOX OMEODOMINIO: legame al DNA e formazione di dimeri KNOX1 KNOX1: repressione di geni bersaglio KNOX2 KNOX2: formazione di dimeri ELK ELK: localizzazione nucleare? repressione trascrizionale?

12 I GENI KNOX NON SONO GENI OMEOTICI I geni KNOX non sono coinvolti nella determinazione del destino degli organi Tale funzione nella piante è assolta dai fattori di trascrizione MADS, che non contengono un omeodominio nella loro struttura proteica

13 MAIS ARABIDOPSIS KN1 STM KNAT1 I geni KNOX di classe I contribuiscono al mantenimento dello stato indifferenziato del meristema apicale e la loro sottoregolazione nei siti di formazione dei primordi fogliari sembra essere funzionale all’organogenesi fogliare IBBA - PFG

14 SHOOT MERISTEMLESS (STM) E’ NECESSARIO PER LA FORMAZIONE E IL MANTENIMENTO DEL SAM Long and Barton (1998) Piante di Arabidopsis con una mutazione stm in un allele riescono a formare soltanto i cotiledoni wt Stm-1 Long et al., (1996) Piante omozigoti stm-2 formano organi a partire dai cotiledoni fusi Clark et al., (1996) IBBA - PFG

15 Il mutante di Arabidopsis nel gene KNAT1- BP presenta stelo raccorciato rispetto al wt e silique rivolte verso il basso Koornneef et al.,(1983) Vollbrecht et al., (2000) Il mutante KN1 di mais presenta alterazioni nella formazione dello stelo

16 L’ESPRESSIONE ECTOPICA DI KN1 E’ SUFFICIENTE PER INDURRE LA DIVISIONE CELLULARE Smith et al., (1992) IBBA - PFG

17 PIANTE DI ARABIDOPSIS MUTANTI PER IL GENE WUSCHEL (WUS) MANCANO DEL MERISTEMA APICALE VEGETATIVO IBBA - PFG Wt Wus Wt Laux et al., 1996

18 PIANTE DI ARABIDOPSIS MUTANTI PER IL GENE WUSCHEL (WUS) PRESENTANO STRUTTURE FIORALI ALTERATE IBBA - PFG

19 WUS STM I geni homeobox WUSCHEL e STM sono espressi precocemente durante l’embriogenesi

20 IL DIFFERENZIAMENTO DELLE “STEM CELLS” NEL MERISTEMA APICALE È REGOLATO DAI GENI CLAVATA (CLV1, CLV2 E CLV3) Meristemi dell’infiorescenza di piante di Arabidopsis wt e clavata1 (Clark et al., 1993) I meristemi di piante clv1-5 (B) sono più larghi rispetto al wt, mentre quelli di clv1-1 di solito assumono una forma fasciata (C). IBBA - PFG

21 I GENI CLAVATA (CLV1, CLV2 E CLV3) CODIFICANO PER I COMPONENTI DI UN SISTEMA DI TRASDUZIONE DI SEGNALE IBBA - PFG

22 Il mantenimento delle stem cells e la grandezza del meristema apicale dipendono dalla regolazione reciproca di CLAVATA3 e WUS Nei mutanti clv l’espressione di wus si espande apicalmente e lateralmente

23 IBBA - PFG

24 La possibilità di trasferire geni a specie di interesse agronomico dipende dalla possibilità di: - trasformare le cellule vegetali di una certa specie - rigenerare delle piante dalle cellule trasformate - la rigenerazione dipende dalla scelta di un giusto bilancio di ormoni vegetali che differisce da specie a specie Molte piante agrarie hanno problemi di rigenerazione e coltura in vitro (specie recalcitranti) Trasferimento genico in specie di interesse agrario per il miglioramento genetico

25 IBBA - PFG coltura di espianti fogliari in presenza di ormoni formazione di callo RIGENERAZIONE PER EMBRIOGENESI SOMATICA: l'induzione di una popolazione cellulare con capacità embriogeniche, in grado cioé di percorrere gli stadi di sviluppo che a partire da una singola cellula somatica, portano alla formazione di un embrione (somatico) del tutto simile a quello (zigotico) che si origina dopo la fecondazione di una cellula uovo da parte di un granulo di polline RIGENERAZIONE PER ORGANOGENESI: la rigenerazione diretta di un germoglio a partire da un esiguo numero di cellule somatiche che. Sigenera una plantula geneticamente identica alla pianta "madre" MECCANISMI DI RIGENERAZIONE IN VITRO