CLONAGGIO POSIZIONALE

Presentazione sul tema: "CLONAGGIO POSIZIONALE"— Transcript della presentazione:

1 CLONAGGIO POSIZIONALE
CLONAGGIO FUNZIONALE

2 1 2 3 4 5 Identificazione di geni-malattia attraverso la strategia del clonaggio posizionale

3 Geni presenti in una regione di 500 kb del cromosoma 6 umano (6p21.1)
Oggi per molte regioni di genoma è possibile passare direttamente dalla fase 1) alla fase 4) Geni presenti in una regione di 500 kb del cromosoma 6 umano (6p21.1) I geni presenti all’interno della regione identificata con l’analisi di linkage vengono valutati e si stila un elenco di geni ‘candidati’

4 Come si stabilisce l’ordine di priorità dei geni candidati?
Funzione appropriata esempi rodopsina per la retinite pigmentosa; fibrillina per la sindrome di Marfan Espressione spazio-temporale appropriata esempio  i geni le cui mutazioni determinano difetti del tubo neurale devono essere espressi in questa struttura prima della sua chiusura Omologie e relazioni funzionali con geni noti e di cui si conoscono mutazioni patologiche esempio  ligando e suo recettore; componenti di una stessa via metabolica Omologie con fenotipi simili in organismi modello

5 Clonaggio posizionale in epoca pre-sequenziamento genoma umano
L’identificazione del gene della DMD Due gruppi sono arrivati in maniera indipendente a questo risultato 1) attraverso un paziente che aveva una delezione citologicamente rilevabile di una regione in Xp21 2) attraverso una delle rarissime donne (una ventina in tutto il mondo) che presentano la malattia

6 Kunkel et al PNAS 82: 1) hanno utilizzato il clonaggio per sottrazione (concettualmente semplice ma tecnicamente molto complesso)

7 Clonaggio per sottrazione
Il DNA 2. è in grande eccesso rispetto all’1: si favorisce la formazione di eteroduplex (1)-(2) rispetto a quella di omoduplex (1)-(1) 1. DNA di una linea cellulare 49, XXXXY digerito con MboI (frammenti con estremità adesive) 2. DNA del paziente DMD con la delezione (frammentato con sonicazione) I 2 DNA denaturati vengono mischiati e fatti rinaturare (A) Omoduplex (1)-(1), hanno estremità adesive: possono essere clonati in un vettore con estremità adesive complementari (B) eteroduplex (1)-(2), un filamento è privo di estremità adesive: non possono essere clonati (C) omoduplex (2)-(2), non hanno estremità adesive: non possono essere clonati Questi frammenti sono arricchiti per le sequenze che non sono presenti nel DNA 2, vengono utilizzati per la costruzione di una libreria

8 Le sequenze clonate sono state testate per individuare quelle realmente non presenti nel paziente con la delezione

9 Le sequenze così ottenute sona state usate come sonde di ibridazione su Southern blot di DNA di malati DMD e di controlli normali

10 Worton et al. 1987 Donna affetta da DMD portatrice di una traslocazione bilanciata X-21 Il punto di rottura sul cromosoma X è dentro il gene DMD Il tratto di cromosoma 21 traslocato porta geni per l’rRNA sul cromosoma X Costruzione di una libreria di DNA genomico della donna affetta Identificazione dei cloni contenenti sia sequenze del cromosoma X che sequenze per l’rRNA

11

12 Clonaggio funzionale  si arriva al clonaggio del gene malattia attraverso inferenze sulla funzione la cui alterazione provoca la patologia Pochi esempi  clonaggio del gene implicato in una grave forma di emofilia

13 Gene del fattore VIII della coagulazione – suo isolamento da una banca di cDNA di maiale
Isolamento del DNA genomico (di maiale) e suo uso come sonda per isolare il corrispondente gene umano

14 OMIM = Online Mendelian Inheritance in Man
Versione online del catalogo dei fenotipi mendeliani umani (la ‘Bibbia’ dei genetisti medici) edito in versione cartacea fin dal 1966 a cura di Victor McKusick (sei edizioni: la prima nel 1966, l’ultima nel 1998) E’ un compendio dei geni e dei fenotipi umani Contiene informazioni su > geni e su tutte le malattie e i fenotipi mendeliani noti

15 il significato della prima cifra:
Ogni voce (‘entry’) è contrassegnata da un numero a sei cifre preceduto da un simbolo il significato della prima cifra: e ‘entries’ create prima del 15/05/ riguardanti loci o fenotipi autosomici ‘entries’ riguardanti loci o fenotipi X- linked ‘entries’ di loci o fenotipi Y-linked ‘entries’ di loci o fenotipi mitocondriali ‘entries’ di loci o fenotipi autosomici creati dopo il 15/05/1994

16 il significato del simbolo che precede il numero:
* gene # fenotipo + gene a sequenza nota + fenotipo % fenotipo mendeliano a base molecolare nota no simbolo fenotipo a sospetta (ma non confermata) eredità mendeliana Esempi relativi alla CF (= Cystic Fibrosis) Il gene *602421 La malattia 1 (CF) #219700 La malattia 2 (CBAVD) #277180

17 Per ogni gene il database fornisce numerose informazioni cliniche, genetico-molecolari , popolazionistiche, una serie di ‘link’ ad altri siti e un’ampia bibliografia