FARMACOLOGIA APPLICATA LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto.

Presentazione sul tema: "FARMACOLOGIA APPLICATA LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto."— Transcript della presentazione:

1 FARMACOLOGIA APPLICATA LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo roberto.russo@unina.it

2 La depressione è la manifestazione più comune tra i disordini affettivi e comprende: componenti emozionali: sensazione generale di disagio, apatia e pessimismo, bassa autostima, senso di colpa e di inadeguatezza, indecisione, perdita di motivazione componenti biologiche: ritardo del pensiero e dell’azione, disturbi del sonno e perdita dell’appetito, perdita della libido

3 Le sindromi depressive sono di due tipi: unipolare: in cui le variazioni di umore sono sempre nella stessa direzione (75% dei casi) non familiare, associata a situazioni di forte stress emotivo, accompagnata ad ansia ed agitazione bipolare: in cui i pazienti oscillano tra depressione e mania (25% dei casi) Familiare, non correlata ad eventi esterni I farmaci antidepressivi non mostrano una selettività significativa tra le due condizioni

4 La principale teoria biochimica alla base della depressione è rappresentata dall’ipotesi monoaminergica di Schildkraut (1965) Secondo la quale la depressione è determinata da un deficit funzionale dei trasmettitori monoaminergici (noradrenalina e serotonina) in alcune aree celebrali. Sebbene tale ipotesi si ritiene superata la manipolazione farmacologica della trasmissione monoaminergica resta l’approccio terapeutico più di successo

5 Test in vitro

6 Inibizione dell’uptake della [ 3 H]-noradrenalina in sinaptosomi celebrali di ratto Il meccanismo di re-uptake della noradrenalina è il più importante processo fisiologico per rimuovere la NA dallo spazio sinaptico. L’inibizione di tale uptake è uno dei più importanti meccanismi d’azione dei f. antidepressivi. L’ipotalamo è la regione del cervello in cui si ha la maggiore concentrazione di NA e quindi di uptake

7 PROCEDURA Si preleva rapidamente il cervello di ratto, si pone in ghiaccio e si separa la regione ipotalamica L’ipotalamo viene pesato, omogenato e centrifugato. Il surnatante verrà usato per il saggio. Il campione ottenuto + tampone + F (standard/veicolo) sono incubati a 37°C in atmosfera 95% O 2 - 5% CO 2 per 5 minuti Per ogni saggio 3 campioni sono incubati col veicolo nelle stesse condizioni ma a 0°C I campioni sono centrifugati ed il pellet è dissolto in una sol. Triton- X/etanolo sotto agitazione. Alle sospensioni ottenute si aggiunge il liquido di scintillazione e si legge la radioattività con il  counter

8 Valutazione dei risultati L’uptake a 0°C è di tipo aspecifico L’uptake reale è la differenza tra la radioattività (cpm) ottenuta a 37°C e a 0°C [ 3 H]-noradrenalina + veicolo = cpm totali [ 3 H]-noradrenalina + amitriptilina (std)/ campione = cpm specifici % inibizione = cpm specifici/cpm totali * 100

9 Questa metodica si attua anche per lo studio di inibitori dell’uptake della dopamina e 5-HT Dopamina: corpo striato di ratto, std = nomifensina Serotonina: cervelletto ed ipotalamo di ratto, std = clorimipramina

10 Inibizione dell’attività delle MAO in sinaptosomi di ratto Le monoaminoossidasi (A e B) sono enzimi che regolano i livelli endogeni ed esogeni di amine. MAO A = serotonina, noradrenalina MAO B = benzilamina, β-feniletilamina MAO asp. = dopamina, tiramina Gli inibitori della MAO A hanno azione antidepressiva.

11 PROCEDURA Si preleva il cervello di ratto (130-150 g) e si separa il cervelletto, che viene pesato, omogenato e centrifugato Il surnatante viene sottoposto ad una serie di centrifugazioni al fine di ottenere un pellet ricco di MAO mitocondriali. I campioni così ottenuti sono incubati con: - tampone + H 2 O + veicolo - tampone + H 2 O + std/campione Si lascia a 37°C per 15 minuti e si aggiunge il substrato ( 14 C-5HT o 14 C  - feniletilamina) Si lascia per 30 minuti a 37°C e si ferma la reazione con HCl Si aggiunge dietiletere e si centrifuga. Alla fase organica si aggiunge il liquido di scintillazione e si legge la radioattività con il  counter

12 Valutazione dei risultati [ 14 C]-5HT + veicolo = cpm totali [ 14 C]-5HT + deprenil (std) / campione = cpm specifici % inibizione = cpm specifici / cpm totali * 100

13 Saggi in vivo

14 Despair Swim test nel ratto (Forced swimming test; Test di Porsolt, 1977) In ratti forzati a nuotare in uno spazio chiuso si verifica una immobilità, indice di uno stato di panico. Questo comportamento, che riflette uno “stato di abiezione”, è assimilabile alla depressione nell’uomo.

15 Procedura Gli animali vengono posti un giorno prima dell’esperimento in gabbie individuali con libero accesso a cibo e acqua Singolarmente, gli animali sono forzati a nuotare in un cilindro di plexiglass (h40 x d18 cm) pieno d’acqua (15 cm) a 25°C. Alla prima immersione il ratto inizialmente nuota vigorosamente e cerca di arrampicarsi sulle pareti. Dopo 2-3 minuti comincia ad alternare fasi di immobilità con fasi di attività. Dopo 5-6 minuti resta immobile per l’80% del tempo Dopo 15 minuti il ratto viene prelevato, asciugato con aria calda e posto nella sua gabbia. Dopo 24h la procedura viene ripetuta e la durata dell’immobilità viene valutata per 5 minuti. Il farmaco da testare o lo standard (imipramina) sono somministrati 1h prima del test

16 Valutazione dei risultati Il tempo di immobilità ottenuto dagli animali trattati (a diverse dosi) sarà paragonato a quello degli animali di controllo. L’efficacia sarà valutata paragonando gli animali trattati con f. da testare con quelli trattati con lo standard (controllo positivo)

17 Learned helplessness “Test dell’impotenza acquisita” Animali, esposti a situazioni avverse non controllabili, soffrono di alterazioni motivazionali ed emotive che gli impediscono di rispondere adeguatamente ad eventi traumatici successivi.

18 Learned helplessness Cani che ricevono scosse elettriche non evitabili sono incapaci, in seguito, di apprendere risposte che permettono loro di evitare scosse della stessa intensità. Questo comportamento riflette che “l’organismo ha imparato che la situazione è incontrollabile”

19 Tail suspension test Si basa sempre sul concetto “dell’impotenza acquisita” Si misura il tempo di immobilità di topi sospesi per la coda

20 Tail suspension test

21 Muricide behaviour in rats PROCEDIMENTO: Isolamento di animali per 6 settimane. Se ratti (120 130g). Tali ratti vengono posti in gabbie con altri ratti e si valuta il tempo di latenza (tempo impiegato dal ratto per attaccare). Gli animali sono trattati con il veicolo, con il farmaco standard (triciclici) o con il f. campione. VALUTAZIONE: Numero di ratti muricidi in 5 minuti

22 Modelli di separazione Giovani scimmie sono separate dalle madri. Prima fase (“di protesta”): agitazione, insonnia, intensa vocalizzazione Seconda fase (“di disperazione”): diminuzione dell’appetito, dell’attitudine al gioco e delle relazioni sociali

23 Test dell’ipotermia da reserpina nel topo Uno degli effetti centrali della deplezione di amine biogene indotta dalla reserpina è l’ipotermia Tale riduzione della temperatura è antagonizzata sia da antidepressivi che da stimolanti centrali Tuttavia gli antidepressivi hanno un’azione lenta ma duratura nel tempo mentre gli stimolanti hanno un’azione rapida ma fugace

24 Procedura Gruppi di 5 topi vengono trattati con reserpina (2 mg/kg) sottocute Dopo 18h i topi vengono posti in gabbie individuali e viene misurata la temperatura rettale mediante un termometro elettronico ad una profondità di 2 cm. Si effettua quindi la somministrazione (i.p. o per os) del farmaco da testare (e lo std) e si monitora la temperatura ogni ora per le successive 7h.

25 Valutazione dei risultati Il parametro considerato è la variazione della temperatura nel tempo. Si ottiene una curva per ogni trattamento (controllo, trattato) Si effettua un’analisi della varianza In alternativa si valuta la max differenza tra la temperatura iniziale e quelle misurate nelle 7h successive nei diversi gruppi. Si confrontano i due valori con il t-test

26 Si valutano anche: - PTOSI (2h dopo la reserpina) Score 0 : occhio aperto “ 1 : occhio semiaperto “ 2: occhio chiuso - ACINESIA (2h dopo la reserpina) attivi o inattivi

27 Potenziamento da 5-idrossitriptofano La somm. di 5-HT provoca tremori nel ratto Si somministra 5-HT (i.p.), 1h dopo i F da valutare VALUTAZIONE: Numero di ratti “tremanti” 0.5-8h dopo la somm. di 5- HT ATTIVI: inibitori MAO A INATTIVI: inibitori MAO B e F triciclici

28 FINE