LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE

Presentazione sul tema: "LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE"— Transcript della presentazione:

1 LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE
ESPERIENZA N. 1: DETERMINAZIONE SPETTROENZIMATICA DELL’AMIDO

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AMIDO: POLISACCARIDE DI RISERVA DEL REGNO VEGETALE

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AMIDO: POLISACCARIDE DI RISERVA DEL REGNO VEGETALE Si trova principalmente negli organi di riserva (tuberi, radici, semi ecc.) E’ un polimero del glucosio con legami a1,4 (amilosio) e a1,6 (amilopectina)

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AMIDO e CELLULOSA: Legame a 1,4 Legame a 1,6

5 LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE
Altri zuccheri di riserva sono: b 1,6 Definiti in generale fruttosani b 1,2

6 LABORATORIO DI FISIOLOGIA VEGETALE
TIPOLOGIE DI AMIDO

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PERICARPO PARETE CELLULARE PROTEINA AMIDO ENDOSPERMA AMIDACEO

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Determinazione dell’amido Principio del metodo Il metodo utilizzato sfrutta il differente spetto di assorbimento nell’UV-Vis. della forma ossidata e di quella ridotta dell’NADP

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Determinazione dell’amido Reazioni Si effettuerà un dosaggio utilizzando un sistema spettro-enzimatico, mediante questo sistema di reazioni: Amido + (n-1) H2O n D-glucosio; D glucosio + ATP G-6-P + ADP; G-6-P + NADP D-gluconato 6P + NADPH + H+ Le reazioni sono stechiometriche per cui si otterrà una quantità di NADPH proporzionale alla quantità di amido presente. AGS = amiloglucosidasi; HK = esochinasi G6P-DH = glucosio 6-P deidrogenasi AGS HK G6P-DH

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Determinazione dell’amido Contenuto del Kit: Soluzione 1: amiloglucosidasi in buffer citrato; Soluzione 2: NADP, ATP in trietanolamina buffer; Sospensione 3: miscela di esochinasi e glucosio 6-P deidrogenasi

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Determinazione dell’amido Contenuto del Kit: Soluzione 2 NADP, ATP Soluzione 1 Amiloglucosidasi Sospensione 3 Esochinasi e Glucosio 6P deidrogenasi

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Determinazione dell’amido Reagenti necessari: Dimetilsulfossido (DMSO) ed HCl 8M per solubilizzare l’amido; NaOH 5 M per aggiustare il pH; Kit enzimatico.

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Determinazione dell’amido Strumentazione: Bagno termostatato a 55 60°C Spettrofotometro regolato a 340 nm

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Determinazione dell’amido Preparazione del campione: Polverizzare il campione con un mulino o un omogenizzatore; Pesarne accuratamente 100 mg; Porli in una beuta ed aggiungere 20 ml di DMSO e poi 5 ml di HCl 8M Parafilmare e porre ad incubare per 30’ a 60°C; Raffreddare rapidamente a 20 25°C con 50 ml di H2O e portare il pH a 4–5 con NaOH 5M; Portare a volume fino a 100 ml. Prelevare 100 ml per ogni determinazione.

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Determinazione dell’amido Procedimento:

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Determinazione dell’amido Calcolo: Contenuto amido g/l soluzione: Dove: DA = (A2 – A1) campione – (A2- A1) del bianco V = volume finale (ml) = 2,320; PM = Peso Molecolare glucosio – Peso Molecolare acqua = 162,1; v = volume del campione (ml) = 0,100; d = lunghezza del cammino ottico (cm) = 1 e = coefficiente di estinzione molare dell’NADPH a 340 nm = 6,3

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Determinazione dell’amido Calcolo: Contenuto amido g/l soluzione: C = 0,597 x DA

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Determinazione dell’amido Calcolo: Contenuto amido g/100g PS :

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Determinazione dell’amido FINE