Laboratorio n° 6: I batteri fitopatogeni. Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Sintomi dei batteri fitopatogeni 1.2. Tecniche di inoculo dei batteri.

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1 Laboratorio n° 6: I batteri fitopatogeni

2 Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Sintomi dei batteri fitopatogeni 1.2. Tecniche di inoculo dei batteri fitopatogeni 1.3. I patogeni oggetto della lezione: Pseudomonas savastanoi (PS), Agrobacterium tumefaciens (AT) Attività di laboratorio 3.1. Coltivazione e trasferimento dei batteri 3.2. Preparazione delle sospensioni batteriche 3.3. Preparazione dell’inoculo di PS e AT 3.4. Inoculo con PS 3.5. Inoculo con AT

3 Differenze tra funghi e batteri I batteri fitopatogeni: - organismi procarioti - le cellule batteriche sono di dimensioni inferiori (1-4 micron) alle spore fungine - molti batteri fitopatogeni sono parassiti facoltativi, quindi sono facilmente coltivabili su substrati agarizzati - Circa 30 generi di batteri producono circa 300 malattie delle piante - Richiedono, rispetto ai funghi, la presenza di un continuo “film” liquido sulle superfici per svilupparsi e diffondersi - I batteri vengono indicati con la consueta classificazione latina binomiale a cui si può aggiungere la “pathovar” (pv). Questa è utilizzata per indicare batteri di una stessa specie che attaccano specifiche specie vegetali

4 Differenze tra funghi e batteri

5 Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni

6 Ralstonia solanacearum (appassimento) – patogeno vascolare

7 Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni Erwinia amylovora (colpo di fuoco delle pomacee) – emissione di mucillagini costituite da enzimi extracellulari e cellule batteriche “ooze”

8 Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni: tumori Agrobacterium tumefaciens Pseudomonas savastanoi

9 Pseudomonas syringae pv. tomato (Macchiettatura batterica del pomodoro). Sintomi indotti dai batteri fitopatogeni: macchie fogliari Rispetto ai funghi, le macchie fogliari dovuti ai batteri sono più irregolari e “angolari” in relazione alla morfologia della foglia, in quanto i batteri hanno maggiori difficoltà nel superare ostacoli fisici (venature). Spesso le macchie fogliari sono idropiche (water-soaking) a causa della distruzione enzimatica dei tessuti vegetali

10 Comunemente vengono utilizzate cellule vive dei patogeni. Questo richiede che la colonia di partenza sia “rinnovata” con frequenza. Rinnovo delle colonie batteriche: - rinnovo attraverso “scrisciamento” su substrato NAG - tecnica finalizzata a “diluire” in piastra la popolazione batterica fino ad ottenere colonie singole Coltivazione e inoculo di batteri fitopatogeni

11 Isolamento di batteri fitopatogeni (1:2) Isolamento da fusti infetti: - Fusti di olivo presumibilmente attaccati da Pseudomonas savastanoi (rogna dell’olivo) Sintomi e segni osservabili: - Tumori

12 Inoculo di batteri fitopatogeni: AT Agrobacterium tumefaciens (AT) agente causale del tumore batterico

13 Inoculo di batteri fitopatogeni: AT TIPI DI INOCULO: 1_Sospensione di cellule batterice inoculate nel fusto

14 Isolamento di batteri fitopatogeni (2:2) Inoculo in foglie di tabacco dei batteri isolati da tumori Reazione di ipersensibilità: - La reazione di ipersensibilità (HR) è un meccanismo utilizzato dalle piante per prevenire e limitare la diffusione di infezioni duvute a patogeni. HR è caratterizzata dalla rapida morte delle cellule coinvolte nell’infezione. La morte cellulare è legata all’accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS).

15 L’identificazione dei batteri Il sistema Biolog permette una rapida identificazione di oltre 2,500 specie di batteri aerobici e anaerobici, lieviti ed alcuni funghi. Il sistema su basa sull’analisi di profili metabolici delle specie microbiche. Piastra da 96 pozzetti “caricata” con differenti substrati organici. L’attività microbica determina l’ossidazione del substrato con sviluppo di colore viola Lettura automatica del profilo funzionale e identificazione della specie attraverso confronto con banca dati

16 Attività di laboratorio

17 Computo dei materiali e attività Inoculo delle sospensioni batteriche (1 x 10 5 ; 1 x 10 6 ; 1 x 10 7 ) su foglie di tabacco mediante infiltrazione con siringa Preparazione e quantificazione dell’inoculo batterico: - selezionare delle colonie batteriche - prelevare parte della colonia con un’ansa sterile - “stemperare” la colonia batterica in un tubo con acqua sterile - quantificazione della colonia batterica attraverso lettura dell’assorbanza ottica allo spettrofotometro (lunghezza d’onda 530 nm) - calcolo della concentrazione batterica attraverso confronto del valore rilevato allo spettrofotometro con la retta di taratura. La retta è stata precedentemente ottenuta attraverso diluizione seriali e conte su substrato. - diluire la sospensione batterica fino alla concentrazione desiderata - applicazione della sospensione batterica sul materiale vegetale Inoculo di sospensioni batteriche (1 x 10 7 ) nel fusto di piante di pomodoro mediante infiltrazione con siringa