OOGENESI IN DROSOPHILA. La generazione e lo sviluppo della camera ovarica sono un ottimo modello per studiare: Rigenerazione cellule staminali adulte.

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1 OOGENESI IN DROSOPHILA

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3 La generazione e lo sviluppo della camera ovarica sono un ottimo modello per studiare: Rigenerazione cellule staminali adulte Differenziamento cellulare Formazione del pattern Specificazione degli assi Varaiazioni nella forma cellulare Migrazione cellulare Allungamento di un tessuto Dinamiche del citoscheletro Biogenesi, trasporto, localizzazione e funzione dell’RNA Tumorogenesi

4 L’ovario presenta caratteristiche che permettono facile manipolazione al pari di colture cellulari: Sono possibili l’analisi a mosaico e il silenziamento mediato da RNAi in maniera più efficace che in altri tessuti. L’ovario è facilmente permeabile a droghe e molecole abbastanza grandi come gli antibiotici. È possibile l’iniezione diretta di materiale nel citosol e l’imaging di camere ovariche dal vivo. Poichè mantiene intatta l’integrità tissutale,rende possibile studiare processi che dipendono dall’interazione di multipli tipi cellulari

5 Sono indicati I principali eventi nello ssviluppo di una camera ovarica. Immagini Z-stack al confocale: nuclei in blu, E-caderina in verde, miosina in rosso. Sotto,singoli immagini al confocale nel mezzo dei tessuti con I nuclei in bianco

6 GFP-Staufen, actina colorata con falloidina (rossa). Nel germarium le c. staminali sono in giallo e si dividono per dare un cistoblasto, in blu. 4 divisioni mitotiche incomplete producono una cisti con 16 cellule unite da canali ad anello (rosso) e con un fusoma Continuo (grigio). Quando lascia il germarium la camera è circondata da un monostrato di circa 600 cellule epiteliali follicolari (verde)

7 Il primo evento di polarizzazione avviene nel germarium: La camera ovarica posteriore induce il diferenziamento delle c. follicolari polari (verde scuro), secernendo Delta (freccia 1). Questo induce il differenziamento delle stalk cells Secernebdo Unpaired (freccia 2) questo induce la sovraregolazione di E-caderina (3, linee arancio), che posiziona l’oocita della cisti vicina.

8 Cellule staminali e cistoblasti contengono uno spettrosoma (punti rossi) che si sviluppano In una struttura ramificata, il Fusoma che orienta ogni divisione della cisti. Nella regione 2a, I complessi sinaptonemali (linee rosse) Si formano lungo I cromosomi delle 2 cellule con 4 canali ad anello (giallo), al loro ingresso in meiosi. A partire dalla regione 2b, Viene selezionato l’oocita, e sarà la sola cellula a rimanere in Meiosi. Nell reg 2a, proteine, RNA e mitocondri (verde), e I centrosomi (cerchi blu), si Accumulano all’anteriore dell’oo- cita. Nella 2b, le estremità- dei Microtubuli sono dirette nell’oo- cita, e le + nelle c.nutrici. Nella Reg. 3, l’oocita si ripolarizza con I microtubuli meno e specifici componenti citoplasmatici Localizzati al cortex posteriorer.

9 Controlli del ciclo cellulare I checkpoints sono un componente fondamentale del controllo del ciclo cellulare, e salvaguardano la stabilità del genoma. La ricombinazione meiotica richiede la formazione di sinapsi tra gli omologhi e dsbreaks, da risolvere prima di andare avanti. In Drosophila, le sinapsi inizialmente compaiono in diverse cellule della cisti-a6 cellule, per restringersi al solo oocita. Mutazioni nei componenti del macchinario per riparare o dsbreaks portano alla loro persistenza e alla attivazione del checkpoint meiotico. Questo porta a un particolare fenotipo in cui è ritrdata sia la meiosi che la condensazione del nucleo e la camera ovarica è ventralizzata. Questo fenotipo ha permesso di fare forward screens per cercare altri componeti di questo macchinario.

10 Solo uno dei sedici cistociti diventa un uovo Le altre quindici cellule si differenziano in cellule nutrici La cellula destinata a diventare oocita è quella situata all ’ estremità più posteriore della camera ovarica

11 L ’ oocita non passa attraverso uno stadio trascrizionalmente attivo La sintesi degli mRNA è circoscritta alle cellule nutrici Le cellule nutrici trasportano attivamente una gran quantità di molecole nel citoplasma dell ’ oocita

12 c.t. mst36Fc

13 Ibridazioni in situ su ovari dissezionati da un ceppo selvatico utilizzando una sonda specifica per il trascritto di toscagermarium primi stadi di una camera ovarica camere ovariche fino allo stadio 7 stadio 8 stadio 10 oocita maturo

14 Costrutti utilizzati per studiare la regione promotrice del gene tosca LacZ P900 1D C1 C2 UGA TSSAUG E E Hc Sac1 Ss E E 3 ’ UTR di SV40 tos genomico 5 ’ UTR3 ’ UTR lacZ ORF LacZ

15 trascritto di tosca in un ceppo selvatico Ibridazione in situ con ribosonda lacZ su ovari di linee transgeniche P900

16 Costrutti utilizzati per studiare la regione promotrice del gene tosca LacZ P900 1D C1 C2 UGA TSSAUG E E Hc Sac1 Ss E E 3 ’ UTR di SV40 tos genomico 5 ’ UTR3 ’ UTR lacZ ORF LacZ

17 Promotore di 373 c.b. Promotore di 200 c.b. Promotore di 100 c.b.

18 Per la maggior parte dei trascritti che si localizzano in maniera specifica durante l ’ oogenesi, le regioni regolative responsabili del riconoscimento di complessi proteici che li ancorano a proteine motrici sono presenti nella regione 3 ’ UTR (bicoid, oskar, K10, nanos, hunchback). Pochi altri casi in letteratura indicano che le regioni regolative responsabili del trasporto e della localizzazione sono presenti al 5 ’ di un trascritto (yem-alpha, gurken).  Studio delle regioni regolative del trascritto di tosca per ricercare le regioni in cis specifiche per la localizzazione

19 Costrutti utilizzati per studiare le regioni regolative per il trasporto e la localizzazione del trascritto del gene tosca TSSAUG E E Ss HcSac1 UGA PstI lacZ UGA PstI 3 ’ UTRtos lacZ 5 ’ UTRtos 3 ’ UTR di SV40 5 ’ UTR3 ’ UTR lacZ ORFtos genomico lacZ 10D 3 ’ UTR di SV40 AUG HcSac1 lacZ 11D 3 ’ UTR di SV40 AUG

20 Ibridazioni in situ su ovari di linee transgeniche con ribosonda specifica per lacZ 3 ’ UTRtos 5 ’ UTRtos 10D 11D

21 Nello studio del promotore del gene tosca i dati indicano che:  in sole 100 c.b. a monte del t.s.s. sono presenti le regioni necessarie e sufficienti ad ottenere una trascrizione sesso e tessuto specifica  nella regione genomica compresa tra 100 e 200 c.b. a monte del t.s.s. esiste una ulteriore sequenza regolativa Nello studio delle regioni responsabili del trasporto e della localizzazione del trascritto di tosca nell ’ oocita i dati indicano che: Nello studio delle regioni responsabili del trasporto e della localizzazione del trascritto di tosca nell ’ oocita i dati indicano che:  le regioni in cis da me esaminate non sono sufficienti a garantire questi processi  le regioni in cis da me esaminate non sono efficientemente riconosciute da fattori in trans che mediano il trasporto

22 Referenze R. Bastock and D.St Johnston (2011) Drosophila oogenesis. Current Biology 18:1082-1087 L. He, X. Wang and DJ Montell (2011) Shining light on Drosophila oogenesis: live imagin of egg development Current Opinion in genetics and Development 21:612-619