MES COSAGR MEtodi sostenibili per il Sequestro del Carbonio Organico nei Suoli AGRari Aspetti chimici e chimico-fisici della dinamica del carbonio (componente.

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1 MES COSAGR MEtodi sostenibili per il Sequestro del Carbonio Organico nei Suoli AGRari Aspetti chimici e chimico-fisici della dinamica del carbonio (componente abiotica) UNITÁ OPERATIVA UNINA-1 Spaccini R., Sannino D., Piccolo A.

2 IMPOSTAZIONE DELLE PROVE IN CAMPO TRA: TRA: aratura tradizionale (circa 35 cm) + fertilizzazione minerale (pari a circa 130 kg N/ha); MIN : minima lavorazione del suolo + fertilizzazione minerale (pari a circa 130 kg N/ha); MIN : minima lavorazione del suolo + fertilizzazione minerale (pari a circa 130 kg N/ha); SOV : coltura da sovescio (Vicia villosa) con lavorazione tradizionale; COM1 e COM2 : aratura tradizionale con apporto di due dosi di compost (marcato al 13 C) pari rispettivamente a circa 130 kg/ha e 260 kg/ha di N ; POR : aratura tradizionale (circa 35 cm) con apporto di fotosensitivizzatori metallo-porfirinici stabilizzatori della sostanza organica mediante accoppiamento ossidativo delle componenti aromatiche ; No POR aratura tradizionale (circa 35 cm) senza aggiunta di fotosensitivizzatori metallo-porfirinici. No POR : aratura tradizionale (circa 35 cm) senza aggiunta di fotosensitivizzatori metallo-porfirinici.

3 frazionamento del suolo in classi di aggregati -indice di stabilità fisica del suolo carbonio organico totale SOM frazione stabile / sostanze umiche - spettroscopia di risonanza magnetica nucleare in fase solida (CPMAS 13 C NMR) Caratterizzazione molecolare SOM Caratterizzazione molecolare SOM - termochemolisi GasCromatografia Spettrometria di Massa (TMAH-GC-MS) Analisi

4 0.5 mm 1 mm 0.25 mm <0.25 mm 40 g Frazionamento del suolo mediante setacciamento in acqua aggregati= (4.75-1) (1-0.50) (0.50-0.25) (<0.25) MWDw Indice di Stabilità strutturale MWDw MeanWeightDiameter in water

5 Napoli: Stabilità strutturale I e III anno 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 TRAMINCOM2PORNoPOR MWD I MWD III Piacenza: Stabilità strutturale I e III annoTorino: Stabilità strutturale I e III anno 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 TRAMINSOVCOM1COM2PORNoPOR MWD I MWD III Potenza: Stabilità strutturale I anno 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 CONTTRACOM 1COM 2

6 Napoli II anno: Carbonio organico bulk soil e aggregati 4.75 – 1.001.0 – 0.500.5 – 0.25< 0.25Bulk soil 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 TRA MINSOVCOM1COM2No POR POR g CO kg -1 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 TRAMINSOVCOM1COM2No PORPOR I anno II anno g CO kg -1 Napoli : Carbonio organico bulk soil

7 Torino II anno: Carbonio organico bulk soil e aggregati 4.75 – 1.001.0 – 0.500.5 – 0.25< 0.25Bulk soil 12.0 14.0 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 TRA MIN SOV COM1 COM2No PORPOR g CO kg -1 I anno II anno Torino : Carbonio organico bulk soil

8 Piacenza II anno: Carbonio organico bulk soil e aggregati 4.75 – 1.001.0 – 0.500.5 – 0.25< 0.25Bulk soil g CO kg -1 I anno II anno Piacenza : Carbonio organico bulk soil g CO kg -1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 TRAMINCOM 2no PORPOR

9 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 TRACOM 1COM 2 g CO kg -1 Potenza I anno: Carbonio organico bulk soil e aggregati 4.75 – 1.001.0 – 0.500.5 – 0.25< 0.25Bulk soil

10 Alkyl C-O carbohydrates 60 110 0 45 Alkyl-C Aromatic (lignin, polyphenols) 160 110 36 -(CH 2 ) n - -CH 3 lipids 56 NH 2 O OH CH 3 aminoacid 56 lignin 173 R-C-OH O Alkyl acids / oxidisized chains Frazione stabile SOM: CPMAS 13C NMR ppm 0255075 100 125 150 175 200 Acidi umici da compost cellulose 106 1 1 4 4 89-84 66 66-62 76 3 2 5 5 134 153 lignin OR OMe MeO O R H H CH 3 O group lignin and C-N aminoacid 45 60

11 ppm 0255075 100 125 150 175 200 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkyl 11.44.112.831.19.131.6 Distribuzione relativa del carbonio organico % *HB 1.12 *HydrophoBic Index= Alkyl-C+Aromatic-C+Phenolic-C C-N+Carbohydrates+Carboxylic *HB correlato alla stabilità della sostanza organica

12 ppm 0255075 100 125 150 175 200 ppm 0255075 100 125 150 175 200 ppm 0255075 100 125 150 175 200 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/ C-N alkylHB Napoli 10.22.210.246.511.719.10.63 Piacenza 11.41.68.646.612.019.80.60 Potenza 11.02.818.636.610.720.30.90 Torino 13.32.811.043.312.517.10.63 0255075 100 125 150 175 200 Napoli Piacenza Potenza Torino Sostanze umiche Suoli controllo tempo 0

13 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkyl*HB Contr 12.22.210.248.511.715.10.63 TRA12.54.018.937.29.318.10.70 MIN14.24.018.636.09.218.00.68 SOV14.24.421.031.39.719.30.81 COM112.54.721.730.610.020.30.88 COM211.65.023.729.210.520.00.95 NoPOR12.63.720.234.910.318.30.73 POR12.84.423.730.510.018.70.88 Napoli I anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

14 ppm 0255075 100 125 150 175 200 NAPOLI III anno frazione stabile TRA COM 1 COM 2

15 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkyl*HB TRA12.13.719.636.99.418.40.87 MIN12.93.519.336.39.318.70.87 SOV13.94.019.334.89.818.20.88 COM112.94.519.932.99.919.90.97 COM 213.05.820.130.810.120.11.04 NoPOR14.54.220.334.78.917.40.88 POR14.34.121.534.09.117.00.94 Napoli III anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

16 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkyl*HB contr 13.32.811.043.312.517.10.63 TRA14.52.610.139.512.518.90.66 MIN12.12.810.740.512.121.90.73 SOV12.73.810.938.712.421.40.76 COM111.13.511.136.812.924.50.86 COM 211.43.511.936.711.624.90.87 NoPOR12.62.410.642.611.520.40.70 POR11.62.610.140.612.622.60.70 Torino I anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

17 ppm 0255075 100 125 150 175 200 TORINO III anno COM 1 TRA SOV

18 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkyl*HB TRA15.93.011.139.911.518.50.66 MIN13.43.812.735.312.022.70.84 SOV13.23.612.934.812.423.10.86 COM111.34.614.830.914.224.11.03 COM 212.45.116.527.313.824.91.13 NoPOR13.73.310.238.211.722.80.75 POR13.04.513.135.912.121.40.84 Torino III anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

19 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkyl*HB cont 12.41.68.646.612.018.80.58 TRA13.31.79.542.711.221.50.65 MIN11.51.810.742.911.821.30.69 COM 212.42.010.839.711.723.50.75 NoPOR11.11.89.142.911.723.50.70 POR11.32.411.039.812.023.60.78 Piacenza I anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

20 ppm 0255075 100 125 150 175 200 PIACENZA III anno COM 2 TRA MIN

21 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alky alkylHB TRA13.32.311.540.911.020.90.70 MIN10.83.714.435.811.923.50.92 COM 211.03.414.735.311.723.90.93 NoPOR12.92.611.839.311.122.30.76 POR12.42.311.540.011.022.80.75 Piacenza III anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

22 carboxylphenolicaromaticcarbohyd CH 3 O/C-N alkylHB cont 12.02.818.637.69.719.30.85 TRA13.13.418.434.09.521.60.94 COM 111.03.818.631.810.424.41.07 COM 211.33.919.029.110.226.51.18 Potenza I anno: sostanze umiche 13 C-NMR CPMAS distribuzione carbonio organico l.s.d. 0.1 l.s.d. 0.02

23 Caratterizzazione molecolare SOM / Pirolisi-TMAH (termochemolisi) - La pirolisi è una tecnica di analisi applicata alle matrici complesse della sostanza organica naturale (legno, SOM, compost) - Tale tecnica si basa sull’uso di alte temperature (400-700 °C), e di reattivi alchilanti (Tetra Metil Ammonio Idrossido-TMAH), in atmosfera di gas inerte (He 2 ), per la scissione dei legami covalenti, che uniscono le diverse componenti della matrice organica, come legami C-C, legami estere, legami etere etc. - Tale trattamento ha lo scopo di semplificare la matrice organica mediante la frammentazione delle componenti organiche in singole molecole e la separazione di prodotti metilati, idonei all’analisi gas cromatografica

24 1 g di suolo setacciato a 2 mm viene posto in navette di quarzo e miscelato con una soluzione di TMAH ( 25% metanolo ) e fatto asciugare sotto un flusso di azoto Il campione viene introdotto in un reattore tubolare e portato a 400° C per 30 min. 400°C He Le molecole rilasciate durante la termochemolisi vengono trasportati da un flusso costante di elio in due trappole, poste in continuo, contenenti cloroformio e mantenute a 0°C 12.0816.0820.0824.0828.0832.0836.0840.0844.0848.08 Time 0 100 % to II com 2 bulk soill 36.96 22.63 17.57 16.7 12.00 14.71 13.07 15.60 20.36 17.90 18.09 21.20 28.24 23.72 24.82 25.54 32.19 31.20 29.17 32.75 33.4335.41 40.75 38.14 44.33 Il contenuto delle due beute viene unito e portato a secco; il residuo secco viene recuperato con circa 1 ml di cloroformio ed analizzato alla GC-MS.

25 Tetra Metil Ammonum Hydroxide (TMAH) CH 3 OH - ROH + RCOO - RO - (CH 3 ) 4 N + + H 2 O ROH + (CH 3 ) 4 N + OH - RCOO - + (CH 3 ) 4 N + RCOO - (CH 3 ) 4 N + CH 3 N + (da Challinor 2001 JAAP Vol. 61 ) GC-MS R-COOR + (CH 3 ) 4 N + OH - Long chain ester (CH 3 ) 3 N + RO CH 3 Methyl ether RCOOCH 3 + (CH 3 ) 3 N Methyl ester

26 TMAH thermochemolysis O M e M e O H H O CH 2 OH H H OH H OH OH H H O O CH 2 OH H H H OH OH H H O CH 2 OH H O H H OH OH H H O O CH 2 OH H H H OH OH H H O H O OMe OR MeO H H C=O OR OR O O C=O C RORO O HO RO H H O C O R O polysaccharide bio-polyester lignin O O CH 3 O O OMe O CH 3 MeO H H CH 3 O CH 3 O CH 2 O H H O H O O H H O O CH 2 O H H O H O O H H O O CH 2 O H H H O O H H O GC-MS

27 Pyrogram of compost G6 P2 G1 P4 P6 S1 S6 S14 G14/15 S4 G4 P18 lignin derivatives 16 C, 9/10 - 16 diCH3O, fame C 9 10 diCH3O, fame C 18 9,10,18 triCH3O, fame C 16, triCH3O, fame mid-chain hydroxy acids fatty acids  -hidroxy acids alkane dioic acids alkanes sterols carbohydrates

28 TORINO II anno Termochemolisi: prodotti della lignina Dai prodotti della lignina, oltre al contenuto totale, è possibile determinare degli indici di stabilità correlati ai processi di ossidazione e degradazione della lignina I prodotti con catena laterale integra sono rappresentativi di materiale vegetale inalterato I derivati della lignina con caratteristiche acide indicano un processo di ossidazione avanzato Ad I derivati aldeidici indicano un iniziale o parziale processo di ossidazione Al Ad/Al Γ G =Ad/undegraded

29 Bulk soil 436492528 624 470487 Ad/Al G Γ G 3.7 3.1 2.3 2.6 1.9 1.5 2.2 1.5 2.8 2.0 2.6 1.7 Ad/Al S Γ S 4.1 3.6 2.8 3.0 2.2 2.0 2.4 2.1 2.4 1.8 2.2 1.6 4.75-1.00 Ad/Al G Ad/Al S 526 2.8 4.0 485 2.2 3.0 603 2.1 2.4 750 2.4 3.0 411 2.2 3.0 465 2.0 3.0 1.00-0.50 Ad/Al G Ad/Al S 435 2.2 4.0 500 2.20 2.90 521 1.4 1.6 650 2.0 2.6 399 1.9 2.6 428 1.6 2.3 0.50-0.25 Ad/Al G Ad/Al S 410 2.2 4.0 400 1.8 2.3 526 1.4 1.7 570 1.4 1.7 373 1.8 2.5 334 1.5 2.3 <0.25 Ad/Al G Ad/Al S 309 1.7 2.1 320 1.4 1.6 398 1.4 1.7 437 1.4 1.7 629 1.4 1.8 792 1.2 1.6 TRA TORINO II anno Termochemolisi: prodotti della lignina (  g g -1 ) MINCOM 1COM 2NoPOR POR

30 marker microbici marker vegetali componenti di cere cutina e suberina carboidrati acidi grassi -ramificati % catena lunga >C 20 % di/triidrossi acidi  e di/tri idrossi acidi acidi alcan- dioici steroli  idrossiacidi TORINO II anno Termochemolisi componenti alifatiche (  g g -1 )

31 carboidrati acidi grassi di/triidrossi ac. ω- di/tri idrossi ac. acidi alcan-dioici  idrossiacidi overall s.d. ± 10 % Torino II anno Termochemolisi bulk soil: componenti alifatiche (  g g -1 ) - ramificati % - >C 20 % TRAMINCOM1COM2NoPORPOR 546305313460270216 489463653885366415 18 2122720 15323632323738 708116919095117 45457410014523232424 425813015010193 312951963443 steroli

32 Conclusioni Carbonio Organico: alla fine del II anno i trattamenti COM 2 (NA, TO, PZ) e POR hanno mostrato incrementi di CO tra 0.2 e 0.1 % rispetto ai rispettivi controlli Frazione stabile: alla fine del III anno, le sostanze umiche estratte da i trattamenti COM1 e COM 2 hanno mostrato una crescente incorporazione di componenti idrofobiche, alchiliche ed aromatiche, con incrementi dell’indice di idrofobicità. Le sostanze umiche ottenute dai trattamenti POR (NA, TO) hanno mostrato limitati ma significativi incrementi della componente aromatica Termochemolisi: la caratterizzazione della SOM ha rivelato, alla fine del II anno per i trattamenti COM 1 e COM 2, un significativo incremento delle componenti di origine vegetale su bulk soil e frazioni di suolo. Gli indici strutturali della lignina hanno confermato stabilizzazione della componente aromatica nel trattamento POR

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