ordine: Actinomycetales

Presentazione sul tema: "ordine: Actinomycetales"— Transcript della presentazione:

1 ordine: Actinomycetales
famiglia: Corynebacteriaceae genere: Mycobacterium ordine: Actinomycetales famiglia: Corynebacteriaceae genere: Corynebacterium

2 Corynebacterium Gram-positivi Bacilli
Forma a clava e disposizione a palizzata o a ideogrammi cinesi Aerobi facoltativi Asporigeni Immobili Catalasi-positivi Colorazione di Ernst-Neisser Possono presentare alle estremità granulazioni di polifosfati dette metacromatiche perché si tingono in rosso-viola con la colorazione al blu di metilene o di toluidina.

3 Il genere Corynebacterium comprende un ampio gruppo eterogeneo di specie aventi una parete cellulare contenente arabinosio, galattosio, acido meso‑diamminopimclico e (nella maggior parte delle specie) acidi micolici a catena corta. Allo stato attuale sono state definite 46 specie, delle quali più di 30 sono associate a malattie nell'uomo. Ad eccezione delle specie sicuramente patogene (Corynebacterium diphtheriae), i corinebatteri si trovano comunemente nell’ambiente e nella flora microbica umana mucosa e cutanea, questi ceppi saprofiti possono comportarsi da opportunisti, e nei soggetti immunodepressi, causare faringiti, uretriti, e lesioni cutanee purulente.

4 Corynebacterium diphtheriae
C. diphtheriae è un classico modello di virulenza batterica. La tossicità è direttamente attribuita ad una esotossina secreta dai batteri nel focolaio di infezione. Il batterio non necessita di entrare nel torrente ematico per produrre i segni sistemici di malattia. Agente eziologico della DIFTERITE La sorgente d’infezione è rappresentata dai portatori nasofaringei La trasmissione è aerea L’infezione si localizza a: rinofaringe, tonsille, palato molle e laringe Il batterio produce una POTENTE TOSSINA che agisce sia localmente dando necrosi della mucosa, sia a distanza, veicolata dal sangue, causando gravi lesioni degenerative a livello del miocardio, fegato, rene e surrene, nervi cranici e periferici. Il gene tox, che codifica per l'esotossina, è introdotto nei ceppi di C. diphtheriae da un fago lisogeno (fago beta).

5 TOSSINA DIFTERICA Proteina di 58.300 Da
Esempio di classica esotossina A‑B Tossina ADP-ribosilante, provoca l’inibizione della sintesi proteica Presenta tre regioni funzionali: una regione che lega il recettore una regione di traslocazione sulla subunità B una regione catalitica sulla subunità A Il recettore per la tossina è il fattore di crescita epidermico che lega l'eparina ed è presente sulla superficie di molte cellule eucariotiche, in particolare su cellule cardiache e nervose. Questo spiega i sintomi cardiaci e neurologici osservati in pazienti con difteriti gravi

6 MECCANISMO D’AZIONE DELLA TOSSINA DIFTERICA
Una volta che la tossina si lega alla cellula ospite, la regione di traslocazione viene inserita nella membrana dell'endosoma facilitando il movimento della regione catalitica nel citosol Poiché il turnover di EF‑2 è molto lento ed è presente in una cellula solo una molecola per ribosoma, si è stimato clic una sola molecola di esotossina possa inattivare l'intero contenuto di EF‑2 di una cellula, bloccando completamente la sintesi proteica della cellula ospite Poiché il turnover cellulare di EF‑2 è molto lento ed è presente in una copia per ribosoma, si è stimato che una sola molecola di esotossina possa bloccare completamente la sintesi proteica della cellula ospite

7 Nanoparticelle con tossina difterica per sconfiggere il cancro al pancreas
Ottimismo degli scienziati sulla possibilità di avviare in futuro studi preclinici sugli animali fino ad arrivare a un nuovo approccio terapeutico Fonte: © ASSOBIOTEC.it - Pubblicata il 30/09/2008

8 Epidemiologia La difterite è una malattia diffusa in tutto il mondo in particolare in aree urbane povere ed affollate e dove il livello protettivo di immunità indotta dal vaccino è basso. La più grave epidemia negli ultimi anni del 20° secolo si è verificata in Unione Sovietica 1994 (sono stati documentati quasi casi con 1746 morti). La difterite è divenuta poco comune in Occidente in seguito ad un esteso programma di immunizzazione attiva C. diphtheriae è presente nella popolazione perché esistono ospiti, asintomatici (vettori e serbatoio). C. diphtheriae si trasmette da persona a persona mediante le goccioline di saliva

9 ANIFESTAZIONI CLINICHE
L'esposizione a C. diphtheriae può dar luogo a: - Colonizzazione asintomatica in persone con uno stato ottimale di immunità (infezione) Malattia respiratoria lieve Malattia respiratoria grave in pazienti non immuni (mortalità del 30%) Il segno clinico più tipico è la faringotonsillite con presenza di membrane grigiastre che oltrepassano i limiti tonsillari il cui distacco provoca sanguinamento. I sintomi di accompagnamento sono: disfagia, dispnea, cianosi, edema del collo, iperpiressia, nausea e vomito. L’azione della tossina a livello delle alte vie respiratorie può portare ad ostruzione laringea per edema. L’effetto tossico sistemico può causare insufficienza cardiaca progressiva e acuta, insufficienza renale, paralisi della deglutizione.

10 Difterite cutanea La difterite cutanea si trasmette per contatto cutaneo con altre persone infette. Il microorganismo colonizza la pelle e riesce ad entrare nel tessuto sottocutaneo attraverso lesioni della pelle. Prima si sviluppa una papula, che poi evolve in un'ulcera cronica incurabile, talvolta coperta da una membrana grigiastra. Si possono verificare segni sistemici di malattia come risultato degli effetti dell'esotossina

11 (agar cisteina‑tellurito, agar siero‑tellurito, terreno di Löffier).
Diagnosi di laboratorio Esame microscopico I risultati dell'esame microscopico del materiale clinico non sono attendibili. Lapresenza granuli metacromatici non è specifica specifica Si può effettuare un esame microscopico con l’impiego di sieri antitossina coniugati con fluoresceina Esame colturale II campioni devono essere inoculati in terreni non selettivi e in terreni selettivi (agar cisteina‑tellurito, agar siero‑tellurito, terreno di Löffier). Le colonie su agar tellurito assumono un colore grigio‑nero Su agar cisteina‑tellurito C. diphtheriae è stato descritto con tre morfologie di colonie, caratteristiche di biotipi diversi: biotipo gravis : grandi, irregolari e grigie biotipo mitis: più piccole, rotonde, nere biotipo intermedio: piccole, piatte e grigie

12 Saggio di tossigenicità
Tutti i ceppi isolati di C. diphtheriae dovrebbero essere saggiati per la produzione di esotossina. Saggio di immunodiffusiorie in vitro (test di Elek) Saggio di neutralizzazione, usando una antitossina specifica BIOLOGIA MOLECOLARE (Test diagnostico di elezione) Centro per il Controllo e la Prevenzione delle malattie (CDC) ha messo a punto una reazione di PCR per l'identificazione diretta del gene della tossina in campioni clinici (cioè tamponi effettuati su membrane difteriche o materiale bioptico).

13 PROFILASSI Vaccino obbligatorio al 3°, 5° e 11° mese con richiamo al 5° anno di età. Somministrazione di anatossina (tossina inattivata con formaldeide) APPROCCIO TERAPEUTICO Da iniziare subito dopo la diagnosi clinica senza attendere quella microbiologica: U di antitossina per e.v. in 60 minuti. L’eritromicina è utile per eradicare lo stato di portatore.

14 Mycobacterium

15 MORFOLOGIA E GENERALITA’
Bacilli pleomorfi (forme diverse) Gram variabili Immobili Asporigeni Aerobi obbligati Alcool-Acido resistenti

16 CLASSIFICAZIONE tipo: Actinobacteria classe: Actibobacteridae
tipo: Actinobacteria classe: Actibobacteridae ordine: Actinomycetales famiglia: Corynebacteriaceae - genere: Mycobacterium

17 CLASSIFICAZIONE BASATA SUL FENOTIPO
micobatteri a crescita lenta fotocromogeni scotocromogeni non cromogeni micobatteri a crescita rapida

18 CLASSIFICAZIONE BASATA SUL GENOTIPO
geni altamente conservati gene codificante per il 16S rRNA gene codificante per il 23S rRNA spaziatore trascritto, fra 16S e 23S gene codificante per la proteina da shock termico, da 65 kD (hsp65) gene codificante per la superossido dismutasi gene codificante per l’intein gyrA

19 l’elica 18 del 16S rRNA specie a crescita lenta
M. tuberculosis ’ CCA TCG ACG AAG G-- TC CGG GTT CTC TCG GAT TGA CGG TAG GTG GAG AAG AAG CAC M. celatum ’ CCA TCG ACG AAG C-- TG CCG GTT TTC CGG TGG TGA CGG TAG GTG GAG AAG AAG CAC M. chelonae ’ GTA GGG ACG AAG C GA AAG TGA CGG TAC CTA CAG AAG AAG GAC M. fortuitum ’ GTA CCG ACG AAG C GT A.G TGA CGG TAG GTA CAG AAG AAG CAC M. genavense ’ GCA GGG ACG AAG C GC A.G TGA CGG TAC CTG CAG AAG AAG CAC M. lentiflavum ’ GCA GGG ACG AAG C GC A.G TGA CGG TAC CTG CAG AAG AAG CAC M. terrae ’ GTA TCG GCG AAG CTC CG TGG TTT TCT GCG GGG TGA CGG TAA CTG GAG AAG AAG CAC specie a crescita lenta specie a crescita rapida specie correlate a M. simiae specie correlate a M. terrae

20 Mycobacterium complex
Alcune classificazioni propongono di raggruppare in COMPLESSI, sia per la sovrapponibilità dei quadri clinici che presentano che per la notevole similitudine biologica, alcune specie M. tuberculosis complex M. avium complex M. terrae complex M. fortuitum complex Per quanto riguarda i Micobatteri che interessano l’uomo, questi possono essere distinti in due gruppi: complesso dei Micobatteri Tubercolari (MT) complesso dei Micobatteri Atipici o Micobatteri non tubercolari (MOTT) che comprendono germi animali o ambientali a patogenicità occasionale.

21 La gran parte delle infezioni nell'uomo:
Attualmente sono state identificate 100 specie di micobatteri, molte delle quali sono associate a patologia nell'uomo. La gran parte delle infezioni nell'uomo: M. tuberculosis M. bovis M. Leprae M. avium‑intracellulare complex M. kansasii M. fortuitum M. chelonae M. abscessus (Mycobacteria other than tuberculous) MOTT Nonostante questi microrganismi possano infettare qualsiasi organo è di gran lunga preminente la localizzazione polmonare, caratterizzata istologicamente dalla formazione di un tipico granuloma. I MOTT non si trasmettono da uomo a uomo; sono causa di zonosi. Possono provocare patologie a carattere sporadico quali meningiti, linfoadenopatie, broncopneumopatie, infezioni genito-urinarie. Solo in soggetti gravemente immunocompromessi possono causare un’infezione severa.

22 Dializzati (e candidati trapianto) Trapiantati (rene e cuore)
HABITAT I micobatteri sono diffusi nel suolo, nelle acque L’uomo è l’unico serbatoio di infezione. La diffusione di questo microrganismo nell’ambiente è dovuta soprattutto alla sua resistenza all’essiccamento e ai disinfettanti, resistenza imputabile all’alto contenuto di lipidi presenti nella parete cellulare . VIE DI PENETRAZIONE TRANSCUTANEA DIGESTIVA PARENTERALE INALATORIA SOGGETTI A RISCHIO HIV positivi Tossicodipendenti Dializzati (e candidati trapianto) Trapiantati (rene e cuore) Altri? (silicosi, diabete, BPCO…)

23 … I bacilli sono solitamente inspirati con l’aria…
Roberto Koch 1882 … I bacilli sono solitamente inspirati con l’aria…

24 MODELLO IPOTETICO DI RICADUTA DELLE PARTICELLE
PARTICELLE INFETTANTI Goccioline di Pflügge Sospensione nell’aria Evaporazione e riduzione a dimensioni di 1-5 m con bacilli vivi e vitali Possibilità di essere inalati fino a livello alveolare F O N T E

25 P = 1 – e–Iqpt/Q CONTAGIO Il 40-50 % dei contatti stretti si infetta
Nei contagiati il 5-10 % si ammala di TB 3-5 % malati nei primi 2 anni 2-5 % si ammala nell’arco della vita Nei malati: Probabilità di guarigione = 80 % Probabilità di morte = 1 % CONTAGIO PROBABILITÀ D’ INFEZIONE DA AGENTI BIOLOGICI A TRASMISSIONE AEROGENA P = 1 – e–Iqpt/Q P = Probabilità di trasmissione I = Numero di soggetti infettivi q = Quantità di bacilli emessi dal paziente t = tempo di esposizione al contagio p = ventilazione polmonare Q = numero di ricambi d’aria

26 RISCHIO DI INFEZIONE Il rischio aumenta con l’età fino circa a 60 anni in funzione dell’aumento progressivo dell’esposizione (E) che diminuisce a un certo punto (trattini più ravvicinati) Età 10 20 30 40 50 60 70 80 R E

27 "the reemergent killer" Mycobacterium tuberculosis

28 INCIDENZA Nel mondo si calcolano :
oltre 2 miliardi di persone con infezione tubercolare 8 milioni di nuovi casi l’anno 3 milioni di morti soprattutto nei paesi in via di sviluppo Annualmente nei paesi industrializzati si ammalano di tubercolosi 3000 Operatori Sanitari Di essi almeno 200 muoiono

29 UNA MALATTIA PERSISTENTE
Rappuoli R. Nat Med 2004

30 2003: highest estimated TB rates per capita were in Africa
< 10 No estimate per pop 300 or more The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004 Global Tuberculosis Control. WHO Report WHO/HTM/TB/

31 Le infezioni da micobatteri hanno fatto registrare negli ultimi anni un preoccupante incremento dei casi anche nei paesi industrializzati. Tra le cause che stanno determinando il risveglio di una patologia che si riteneva in estinzione dobbiamo annoverare sicuramente la diffusione delle infezioni sostenute da HIV e l’immigrazione di soggetti provenienti da paesi ad alta endemia tubercolare.

32 Campioni positivi (tot 156)
Pazienti HIV negativi Pazienti HIV positivi Agente eziologico Campioni positivi (tot 156) % Campioni positivi (tot 52) M. tuberculosis 114 73.1 27 51.9 M. avium complex 4 2.6 5 9.6 M.xenopi 7 4.5 8 15.4 M. kansaasi 1 0.7 1.9 M. fortuitum complex 15 -- M. gordonae 11 7.1 10 19.3 M. scrofolaceum 2 1.3 M. flavescens Micobatteri isolati da vari materiali patologici durante il periodo in Italia su un totale di 5616

33 EUROPA Notifiche per abitanti

34 Situazione italiana EPIDEMIOLOGIA DELLA TUBERCOLOSI
TASSI DI MORBOSITÀ: 8-10/ CASI KOCH +: 2/ L’ITALIA DEVE ESSERE CONSIDERATA PAESE A BASSA INCIDENZA

35 IMPATTO GENERALE DELLA COINFEZIONE TRA HIV E TB
Infezione TB Infezione HIV Sovrapposizione PROGRESSIONE DELL’INFEZIONE POLMONARE LATENTE VERSO LA MALATTIA TUBERCOLARE 5-10% per anno nei soggetti coinfettati da HIV e TB In Italia 2.5/100/anno in soggetti con CD4 > 350 ml 6.54/100/anno per CD4 tra ml 13.3/100/anno per CD4 < 200 ml

36 AZIONE PATOGENA Questo microrganismo non produce esotossine, quindi l’azione patogena sembra imputabile ad una sua tossicità intrinseca legata ai lipidi della parete cellulare presenti in grande quantità (circa il 60 % del peso secco) Particolare idrofobicità Impermeabilità ai coloranti Alcool-acido resistenza Ritmo di crescita eccezionalmente lento

37 LIPIDI DI PARETE GRASSI:
esteri di acidi grassi a catena lunga (C78-C90) glicolipidi denominati micosidi, che formano il “FATTORE CORDALE” Il FATTORE CORDALE ha potere antigenico Il FATTORE CORDALE conferisce la tendenza ai bacilli a crescere in ammassi cordonali (serpentiniformi) nei terreni liquidi. I ceppi privati del FATTORE CORDALE risultano avirulenti pur conservando la vitalità. Il FATTORE CORDALE è in grado di inibire la migrazione dei polimorfonucleati in vitro e risulta letale se somministrato sottocute nel topo. CERE: esteri di acidi esterificati con alcoli superiori o con polisaccaridi La CERA D, ha il potere di aumentare l’immunogenicità del fattore cordale ed induce inoltre una ipersensibilità di tipo ritardato alla tubercolina La frazione grezza (fattore cordale + cera D + altre componenti proteiche di superficie) è direttamente responsabile della tipica reazione granulomatosa che porta alla formazione del tubercolo comprese la necrosi caseosa.

38 PATOGENESI La produzione e lo sviluppo delle lesioni e la loro guarigione sono legati principalmente al: Numero dei bacilli inoculati (carica batterica) Resistenza e ipersensibilità dell’ospite LESIONI ISTOPATOLOGICHE CARATTERISTICHE DELLA MALATTIA Possono essere di tipo essudativo o produttivo Lesioni essudative: sono presenti nelle fasi iniziali del contagio e sono provocate da una reazione infiammatoria acuta, con edema e richiamo di PMN e monociti nel sito di infezione. Questo tipo di lesione può risolversi (guarigione), o sfociare nel secondo tipo di lesione (lesione essudativa) Lesioni produttive: sono tipiche della fase in cui il soggetto infettato ha sviluppato una ipersensibilità alle proteine tubercolari. Questa lesione corrisponde al granuloma cronico in cui si riconoscono: Una zona centrale con cellule giganti polinucleate contenenti bacilli Una zona intermedia di cellule epitelioidi Una zona periferica di linfoblasti, linfociti e monociti

39 FORMAZIONE DEL TUBERCOLO E DIFFUSIONE DEL MICRORGANISMO NELL’OSPITE
Intorno al granuloma si ha lo sviluppo di tessuto fibroso, necrosi della zona centrale e caseificazione della lesione. Questa formazione prende il nome di tubercolo ROTTURA DEL TUBERCOLO FORMAZIONE DI UNA CAVERNA I micobatteri contenuti nel tubercolo caseificato vengono versati in un bronco DIFFUSIONE DELL’INFEZIONE CALCIFICAZIONE DEL TUBERCOLO GUARIGIONE

40 Patogenesi dell’attivazione dei linfociti T, della formazione del granuloma e della attivazione dei linfociti B nella tubercolosi polmonare

41 Necrosi caseosa in un sito di infezione (parenchima polmonare)
Necrosi caseosa (regione linfonodale)

42 (o PPD = derivato proteico purificato) TEST DELLA TUBERCOLINA
Come si identifica l’infezione tubercolare? TUBERCOLINA (o PPD = derivato proteico purificato) È una miscela antigenica estratta da filtrati di colture dopo ebollizione E’ utilizzata per dimostra la reattività immunologica alla tubercolosi TEST DELLA TUBERCOLINA Si inietta sotto cute con IL TEST DI MANTOUX REAZIONE POSITIVA: formazione di una papula eritematosa nel punto di inoculo. Si manifesta dopo 1-3 gg e rivela una ipersensibilità ritardata e indica un’immunità cellulare nei confronti dei bacilli tubercolari È utile nello screening di massa, per identificare i soggetti da sottoporre a vaccinazione (tubercolino-negativi)

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44 REAZIONE POSITIVA

45 LINEE DIAGNOSTICHE FONDAMENTALI NEL SOSPETTO DI TUBERCOLOSI
INTRADERMOREAZIONE TUBERCOLINICA SECONDO MANTOUX Persona non malata (es. esposta) Determinare l’indice tubercolinico in un gruppo di soggetti Esame di un caso sospetto ESAME RADIOGRAFICO DEL TORACE DIAGNOSI MICROBIOLOGICA

46 Fase preliminare: raccolta del campione
Rappresenta un momento di grande importanza: per il successo del test ed il contemporaneo contenimento dei costi è necessario ottimizzare il volume, la quantità e la qualità dei campioni. un approccio errato alla raccolta conservazione e trasporto dei campioni biologici può irrimediabilmente compromettere ogni successivo sviluppo della fase analitica.

47 RACCOLTA DEL CAMPIONE ESPETTORATO
Alcuni pazienti possono produrre campioni di espettorato difformi tra loro quanto a contenuto di bacilli. Poiché i pazienti possono non eliminare bacilli in modo continuativo nel tempo, dovrebbero essere raccolti 3 campioni per paziente in differenti ore del giorno; tutti i campioni così ottenuti dovrebbero essere processati per esame microscopico e per esame colturale sia in coltura liquidi che solidi. URINE è assolutamente sconsigliato raccogliere le urine delle 24 ore

48 ESAME MICROSCOPICO COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN (carbolfucsina a caldo) COLORAZIONE DI KINYOUN (carbolfucsina a freddo) Decolorante: Acido cloridrico concentrato al 3% in Etanolo al 95% Colorante di contrasto: Bleu di Metilene LETTURA ED INTERPRETAZIONE I vetrini colorati con la fucsina vanno esaminati con obiettivo ad immersione a 100X; i micobatteri appaiono colorati in rosso su uno sfondo blu.

49 ESAME COLTURALE La scelta di un terreno di coltura dipende da molti fattori. Un terreno ideale deve permettere una crescita rapida e rigogliosa dei micobatteri inibire quanto possibile lo sviluppo della flora contaminante essere economico. Attualmente sono disponibili validi sistemi automatizzati e semi automatizzati Tuttavia sia per l’isolamento primario che nelle fasi successive dell’identificazione e dell’esecuzione dei test di farmacosensibilità. rimane d’importanza fondamentale l’uso di terreni tradizionali liquidi e solidi di uso manuale

50 INCUBAZIONE TERRENI LIQUIDI
permettono una buona crescita dei micobatteri in quanto il Tween 80, presente nella composizione, favorisce una buona separazione dei batteri e, di conseguenza, una crescita diffusa e rapida. E’ necessario renderli selettivi con l’aggiunta di farmaci antibatterici. TERRENI DI COLTURA SOLIDI I terreni solidi più utilizzati sono quelle a base di uova fresche, fecola di patate, glicerolo e contengono verde di malachite, con funzione di inibitore della flora associata, in diversa percentuale: il Lowenstein-Jensen (L.J.) ne contiene 0,025%, il Petragnani 0,052% e l’American Thoracic Society 0,02%. INCUBAZIONE Tutti i terreni di coltura vanno esaminati dopo una settimana di incubazione per verificare l’eventuale presenza di micobatteri a rapida crescita o di contaminanti. L’incubazione va protratta per 8 settimane e i tubi si esaminano settimanalmente per rilevare la crescita.

51 Resistenze primarie di MT ai farmaci antitubercolari
TERAPIA Si protrae usualmente per periodi molto lunghi (6-9 mesi), questo perché le molecole utilizzate necessitano per agire di organismi metabolicamente attivi, mentre M. tuberculosis cresce molto lentamente. Si utilizzano contemporaneamente più chemioterapici. Questa condotta diminuisce di gran lunga la possibilità di selezionare resistenti: la notevole quantità di batteri presenti a livello della lesione e la diminuita efficacia delle difese messe in atto dall’ospite permettono ai rari mutanti resistenti di moltiplicarsi *108: micobatteri presenti in una lesione cavitaria Resistenze primarie di MT ai farmaci antitubercolari

52 VACCINO Vaccinazione di Calmette e Guèrin (BCG) (M. bovis attenuato)
E’ comunemente usata nei paesi in cui la tubercolosi è endemica e responsabile di morbilità e mortalità significative. Recenti studi hanno evidenziato che il grado di protezione conferito variare notevolmente. E’ utile nel prevenire le forme più aggressive evitando la disseminazione. Non è di alcun aiuto nelle persone che sono già state infettate e che presentano quindi positività alla reazione cutanea alla tubercolina Il soggetto vaccinato che presenta positività alla tubercolina pone il dubbio se questa sia imputabile ad una infezione o alla riuscita vaccinazione. Circa il 6-12% dei vaccinati va incontro ad un interessamento linfonodale di tipo puramente infiammatorio. La vera complicazione è l’evoluzione in senso suppurativo, che l’OMS stima intorno a 0,14 e 0,34 % nei bambini in età prescolare e fino al 4.3% nei soggetti di età inferiore a due anni.