CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ Un ligando specifico per la proteina di interesse viene legato covalentemente alla resina.

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1 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ Un ligando specifico per la proteina di interesse viene legato covalentemente alla resina

2 2 Interazioni altamente specifiche delle biomolecole: -anticorpo-antigene -Enzima-inibitore reversibile -Enzima-analogo del substrato -Acido nucleico-frammento acido nucleico complementare -Enzima-coenzima -Lectina-glicoproteina La molecola da purificare interagisce in maniera reversibile con un ligando covalentemente fissato sulla matrice insolubile della fase stazionaria. Si forma così un complesso tra molecola da purificare e ligando CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ

3 MATRICE: Deve essere stabile, rigida, un basso potere adsorbente ed avere una grande area di superficie Tra le matrici utilizzate: agarosio, cellulosa, destrano e poliacrilammide

4 SPAZIATORE: Catena di atomi di carbonio che uniscono la matrice al ligando La sua lunghezza è critica per l’efficienza della cromatografia: Se troppo lungo può interagire con le proteine (interazioni idrofobiche) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il ligando e la molecola da purificare

5 LIGANDO: -GENERICO: -GENERICO: una molecola lega gruppi specifici di molecole target Proteina A/G: interagiscono con la parte Fc delle immunoglobuline G (IgG) Lectine: interagiscono reversibilmente con zuccheri specifici. Permettono di separare glicoproteine, glicolipidi, polisaccaridi etc Poly(U): permette la separazione selettiva di mRNA Coloranti: coloranti sintetici come il Cibacron Blue, Procion Red, presentano delle somiglianze strutturali con cofattori di enzimi quali il NAD+ e NADP+: questa caratteristica permette di legare per affinità diverse classi di proteine

6 6 LIGANDI SPECIFICI: la molecola legata alla matrice è specifica per una proteina ESEMPIO ESEMPIO: analogo di un substrato per purificare un enzima, nickel per code di His L’anello imidazolico della catena laterale dell’istidina stabilisce legami di coordinazione con ioni divalenti dei metalli di transizione

7 Legame di un ligando al braccio spaziatore legato alla matrice L’immobilizzazione del ligando può causarne l’inattivazione perché si altera la sua struttura tridimensionale o perché il sito di legame non è più accessibile

8 ELUIZIONE NON SPECIFICA: Si cambia pH, forza ionica o si aggiunge un denaturanteSPECIFICA: Si aggiunge un competitore del substrato che presenta una maggiore affinità per l’enzima da purificare rispetto all’analogo che è legato covalentemente alla matrice

9 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’ per purificare una RNasi Analogo del substrato legato covalentemente alla resina pirimidina

10 + competitore o acido acetico pH 3

11 PURIFICAZIONE DI PROTEINE DI FUSIONE

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13 CROMATOGRAFIA PER IMMUNOAFFINITA’

14 PURIFICAZIONE DI ANTICORPI

15 IMMUNOPRECIPITAZIONE

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19 AFFINITA’ VANTAGGI: Grande capacità di carico (grandi volumi) La proteina è eluita in un piccolo volume Altamente specifica SVANTAGGI: Esecuzione in più tempi Si devono conoscere le caratteristiche della proteina (meccanismo d’azione, affinità per altre molecole, etc.) Eluizione in un tampone a pH e/o forza ionica diverso dal tampone iniziale Costi Inattivazione del ligando Contaminazione dell’agente “spiazzante”