Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working.

Presentazione sul tema: "Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working."— Transcript della presentazione:

1 Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working Bank Archivio Elettronico

2 Acquisizione delle Linee Cellulari Direttamente dal Ricercatore Indirettamente da altri Ricercatori Dalle Banche di Linee Cellulari

3 Banche di Linee Cellulari Continue ATTC: American Type Culture Collection, USA DSMZ: Deusche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GERMANY ECACC: European Collection of Cell Cultures, UK JCRB: Japanese Collection of Research Bioresources, JAPAN

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5 Analisi Isoenzimatica Polipeptidi con identica attività enzimatica sono codificati da più loci; La differente struttura molecolare determina una migrazione elettroforetica polipeptide-specifica; Differenti specie hanno differenti combinazioni isoenzimatiche; Il panel può comprendere 4-7 enzimi AST, G6PD, LDH, MDH, MPI, NP e PEP B. Aspartato amino-transferasi, Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, Lattico deidrogenasi, Malato deidrogenasi, Mannoso fosfato isomerasi, Nucleoside fosforilasi e Peptidasi B

6 -Cross-contaminazioni tra specie umane e murine - Identificazione di specie non mammifere Controllo di Identità Il contaminante deve rappresentare almeno il 10%

7 Cariotipo Costituisce un potente elemento identificativo Fornisce la base per la caratterizzazione molecolare e funzionale

8 Identità Citogenetica DNA Fingerprinting Profilo Isoenzimatico

9 DNA non-codificante contiene mini e micro-satelliti Gli STR o microsatelliti sono una classe di DNA satellite con motivi di 2-6 paia di basi ripetuti un numero variabile di volte I più usati nella pratica sono quelli tetranucleotidici

10 DNA Fingerprinting Stabilisce la derivazione della nuova linea cellulare dal campione originario Conferma dell’identità a differenti passaggi Quantizzazione di una eventuale cross- contaminazione Caratterizzazione genomica di linee “ibride” umane-animali

11 Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working Bank Archivio Elettronico

12 CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA Diagnosi di leucemie e linfomi Diagnosi dei tumori solidi

13 CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE LINEE CELLULARI Il pattern di espressione riflette in linea generale quello della cellula originaria, ma: L’espressione di alcune molecole può non essere stabile nel tempo Differenti MoAb possono riconoscere lo stesso antigene ma con intensità di reazione differente Variazioni intralaboratorio Variazioni interlaboratorio

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15 Espansione e Mantenimento Espansione: processo che porta all’aumento del numero di cellule disponibili con la perfetta conservazione delle caratteristiche bio- funzionali delle cellule. Dopo una fase di espansione è corretto considerare la cellule come archiviabili in una parte della cell bank. Mantenimento: processo che porta all’aumento del numero di cellule disponibili allo scopo di fornirle al gruppo di ricerca che le ha richieste. Il processo di mantenimento è unicamente finalizzato al sacrificio sperimentale delle cellule e non alla loro re- archiviazione. E’ pertanto consentito utilizzare procedure non convenzionali nella fase del mantenimento (divisioni meno frequenti oppure concentrazioni di siero più basse).

16 Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working Bank Archivio Elettronico

17 Criopreservazione Le linee cellulari possono essere criopreservate in azoto liquido a -196°C per oltre 10 anni senza significativi cambiamenti delle loro caratteristiche biologiche Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento

18 Metodica di Congelamento ●Le cellule vanno raccolte nella fase logaritmica di crescita ●Determinare il numero di cellule e la percentuale di vitalità ●Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il sovranatante ●Medium di congelamento: Medium di coltura al 20% FBS + 10% DMSO ●Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio ●Aliquotare in criovials opportunatamente siglate Iniziare il processo di congelamento

19 Punti Critici ●Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo delle cellule ●Agenti crioprotettivi: DMSO, glicerolo. Proteggono la cellule dai danni indotti dalla formazione di cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento ●La lunga esposizione, a temperatura ambiente al DMSO può danneggiare irreversibilmente le cellule ●Non è necessario sterilizzare il DMSO, perchè in forma pura è letale per i batteri

20 Punti Critici Se la velocità di raffreddamento è troppo bassa La cellula è esposta a concentrazioni crescenti di soluti cellulari dovute alla formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione Alta concentrazione di soluti Disidratazione Variazioni di pHAumento della pressione osmotica

21 Punti Critici Se la velocità di raffreddamento è troppo alta Formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione che all’interno della cellula Danno meccanico Cristalli interniCristalli esterni Distruzione della membrana cellulare

22 Esiste la velocità ideale? ●Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare la formazione di ghiaccio ●Il raffeddamento deve essere nello stesso tempo rapido per non danneggiare la cellula per disidratazione Ottimizzazione della velocità: -1°C/minuto

23 -1°C/minuto ● Utilizzo di freezer meccanici programmabili, ma molto costosi ●Utilizzo di contenitori di polistirolo seguito da trasferimento prima a -20°C e poi a 80°C ●Utilizzo dei contenitori criostep

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25 Criopreservazione Vantaggi ●Si riduce il rischio di contaminazione microbica ●Si riduce il rischio di cross-contaminazione ●Si riduce il rischio di drift genetico e morfologico ●E’ possibile utilizzare le linee cellulari a precisi passaggi ●Riduzione di costo e di tempo

26 Procedura di scongelamento 1.Mettere la vial criocongelata nel bagnetto a 37°C 2.Pulire l’esterno con alcool assoluto 3.Aprire la vial sotto cappa e trasferire il contenuto in una falcon sterile contenente 3-5 ml di mezzo completo 4. Centrifugare 5 min a circa 1000g/min per eliminare il DMSO 5.Aspirare il sovranatante 6.Risospendere il pellett cellulare in terreno fresco 7.Seminare

27 Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working Bank Archivio Elettronico Distribuzione a Richiesta Progetti di Ricerca Collection-Related

28 Master Bank Componente della banca che custodisce le linee cellulari dopo la loro acquisizione ed espansione Le cellule della master bank sono rigorosamente sottoposte a test di controllo: 1-Conta e vitalità cellulare 2-Test di rivelazione micoplasma 3-Autentificazione genotipica e fenotica L’accesso è strettamente regolamentato

29 Working Bank Componente della banca che custodisce le linee cellulari che sono correntemente utilizzate dai vari gruppi di lavoro ●Deve essere l’immagine speculare della master bank ●Devono essere disponibili almeno 20 vials di ciascuna linea cellulare L’accesso è meno rigidamente regolamentato

30 Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working Bank Archivio Elettronico

31 Punti Critici di una Cell Line Collection Acquisizione Identità Caratterizzazione Cellulare Espansione Conservazione in Azoto Liquido Master e Working Bank Archivio Elettronico Distribuzione a Richiesta

32 Distribuzione da parte delle Banche ●Linee cellulari contaminant-free ●Documentazione dettagliata ●Facile acquisizione ●Il ricercatore è sollevato dall’incarico di espandere e fornire la linea cellulare ●La linea cellula è preservata da perdite accidentali VANTAGGI