Trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto in mRNA *

Presentazione sul tema: "Trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto in mRNA *"— Transcript della presentazione:

1 Trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto in mRNA *
L’espressione dell’informazione genetica raccolta nelle molecole di DNA, avviene in due stadi: Trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto in mRNA * Traduzione, durante la quale l’mRNA è tradotto per produrre un polipeptide DNA Trascrizione RNA Proteina Traduzione *in seguito alla trascrizione vengono prodotti anche RNA ribosomiale e RNA transfer !!!

2 ovvero Come le informazioni scritte nel DNA vengono ricopiate in RNA
LA TRASCRIZIONE ovvero Come le informazioni scritte nel DNA vengono ricopiate in RNA

3 SINTESI DELL’RNA Come la sintesi del DNA, anche la sintesi dell’RNA richiede uno stampo: anche per la sintesi dell’RNA lo stampo è dato da una (in questo caso una sola) delle due catene del DNA Anche l’RNA viene sintetizzato in direzione 5’  3’ Le RNA polimerasi, a differenza delle DNA polimerasi, possono iniziare la sintesi senza bisogno di un innesco (o primer) I substrati utilizzati sono i ribonucleosidi trifosfati Le RNA polimerasi sono processive

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6 RNA-polimerasi Nucleotidi dell’RNA Direzione della trascrizione Filamento stampo di DNA RNA appena sintetizzato T C A G U

7 LO STAMPO Per la trascrizione, soltanto una delle catene del DNA funziona da stampo: ma è indifferente quale ? Poniamo che debba essere trascritto un tratto di DNA come segue: 5’ GAGTTACATCGCATCGATA 3’ 3’ CTCAATGTAGCGTAGCTAT 5’ Il risultato della trascrizione in RNA (complementare e antiparallela) della catena in alto sarebbe: 5’UAUCGAUGCGAUGUAACUC 3’ Invece, se venisse trascritta la catena in basso, il risultato sarebbe: 5’ GAGUUAGAUCGCAUCGAUA 3’

8 Nel processo di traduzione, l’RNA viene “letto” sempre nella direzione 5’3’, le due sequenze di RNA verrebbero tradotte in due sequenze di amminoacidi completamente diverse ! OCCORRE ALLORA QUALCOSA CHE INDICHI ALLA RNA-POLIMERASI QUALE DELLE DUE CATENE TRASCRIVERE E A PARTIRE DA QUALE NUCLEOTIDE IN POI SEGNALI, ovvero SEQUENZE SPECIFICHE NEL DNA che indicano il punto esatto da cui iniziare a trascrivere (vi sono sequenze poi che indicano dove terminare la trascrizione)

9 I PROMOTORI I PROMOTORI SONO SEQUENZE DEL DNA CHE PERMETTONO L’AVVIO DELLA TRASCRIZIONE SOLO A LIVELLO DELLE PORZIONI DEL GENOMA DESTINATE AD ESSERE TRASCRITTE L’ENZIMA RNA-POLIMERASI HA UN’AFFINITA’ (= CAPACITA’ DI FORMARE LEGAMI) DISCRETA PER QUALSIASI SEQUENZA DEL DNA, E QUINDI POTREBBE LEGARSI DOVUNQUE NEL GENOMA E’ IMPORTANTE DUNQUE CHE VI SIANO SEQUENZE SPECIALI DEL DNA PER LE QUALI L’RNA-POLIMERASI HA UN’AFFINITA’ MOLTO PIU’ ALTA, AFFINCHE’ LA TRASCRIZIONE ABBIA INIZIO SOLO DOVE DEVE AVVENIRE IL PROMOTORE, O MEGLIO I PROMOTORI, SONO QUESTE SEQUENZE CON ALTA AFFINITA’ PER L’RNA-POLIMERASI

10 SI TRATTA DI SEQUENZE LUNGHE ALCUNE CENTINAIA DI NUCLEOTIDI POSTE A UNA PRECISA DISTANZA DAL PRIMO NUCLEOTIDE CHE DEVE ESSERE TRASCRITTO I PROMOTORI DETERMINANO, CON LA LORO SEQUENZA E LA LORO POSIZIONE, SIA L’ORIENTAMENTO DELLA RNA-POLIMERASI (E QUINDI IL FILAMENTO DEL DNA CHE FUNGE DA STAMPO), SIA IL NUCLEOTIDE DAL QUALE DEVE INIZIARE IL PROCESSO DI TRASCRIZIONE PER CIASCUNA PORZIONE DI GENOMA (GENE OPPURE OPERONE, NEI BATTERI) CHE DEVE ESSERE TRASCRITTA

11 Inizio della trascrizione nei procarioti
L’RNA-polimerasi inizia la trascrizione della maggior parte dei geni in una precisa posizione che sta a monte della sequenza codificante La coppia di basi del DNA a livello della quale inizia la trascrizione è chiamata sito di inizio della trascrizione Per convenzione, il sito di inizio della trascrizione nella sequenza del DNA è indicato con +1, e le coppie di basi successive nella direzione in cui avviene la trascrizione sono indicate con numeri positivi, mentre quelle a monte del sito di inizio sono indicate con numeri negativi Oltre alla RNA-polimerasi diverse altre proteine (attivatori, repressori) interagiscono col DNA a livello del promotore o vicino ad esso per regolare l’inizio della trascrizione

12 POSIZIONI DELLE SEQUENZE PIU’ CONSERVATE DEI PROMOTORI PROCARIOTICI

13 L’RNA polimerasi si lega a specifiche sequenze del promotore per iniziare la trascrizione
Ogni subunità ha una specifica funzione

14 La trascrizione a partire da alcuni promotori è iniziata da fattori sigma () alternativi

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17 Terminazione della trascrizione
Esistono parecchi meccanismi per regolare la fine della trascrizione sia nei procarioti che negli eucarioti Nei batteri, uno di essi richiede una proteina, il fattore di terminazione Rho ()

18 UNA SEQUENZA RICCA DI COPPIE C-G SUL DNA RALLENTA LA PROGRESSIONE DELLA RNA-POLIMERASI PER LA MAGGIORE DIFFICOLTA’ DI SEPARARE I DUE FILAMENTI (tre legami H da rompere !) LA PRESENZA DI SEQUENZE PALINDROMICHE PORTA A UN RIPIEGAMENTO DEL RNA TRASCRITTO IN UNA STRUTTURA SECONDARIA CHE RIDUCE DI LUNGHEZZA E DESTABILIZZA L’IBRIDO DNA-RNA A QUESTE SEQUENZE SEGUE SPESSO UNA SEQUENZA RICCA DI COPPIE T-A, CON LA FORMAZIONE DI UN IBRIDO DNA-RNA ESTREMAMENTE INSTABILE IN QUANTO FORMATO DA COPPIE A-U

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20 1) DISTACCO DELL’RNA DALLA CATENA STAMPO
QUESTE CONDIZIONI, IN ASSENZA O CON LA COOPERAZIONE DELLA PROTEINA , PROVOCANO LA FINE DELLA TRASCRIZIONE, OVVERO: 1) DISTACCO DELL’RNA DALLA CATENA STAMPO 2) RI-FORMAZIONE DELLA DOPPIA ELICA DI DNA 3) DISTACCO DELL’RNA-POLIMERASI

21 MATURAZIONE DEGLI RNA NEI PROCARIOTI
mRNA: sono gli RNA messaggeri, ossia quelli che contengono il messaggio per la sintesi di una o più catene polipeptidiche. Essi vengono tradotti man mano che vengono trascritti, senza alcuna rielaborazione dell’estremità 5’ (da cui inizia la traduzione). Talvolta viene modificata l’estremità 3’, ed alcune basi possono esser metilate.

22 Le modificazioni più comuni comprendono:
rRNA e tRNA: gli RNA ribosomiali e transfer, sono trascritti per lo più in unità di trascrizione complesse, ovvero grandi molecole che attraverso successive modificazioni (tagli interni e alle estremità, modificazioni ed aggiunta di nucleotidi) danno luogo a più molecole funzionali di rRNA o tRNA Le modificazioni più comuni comprendono: Tagli all’interno del trascritto (operati da endonucleasi) Eliminazione di nucleotidi alle estremità 5’ e 3’ Modificazioni alle basi Metilazione del ribosio in alcuni nucleotidi

23 Trascrizione rRNA negli eucarioti

24 Tutti i pre-tRNA vanno incontro a tagli e modificazioni di basi

25 LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

26 Organizzazione dei geni, trascrizione e traduzione nei procarioti e negli eucarioti
Translation

27 RNA polimerasi diverse catalizzano negli eucarioti la formazione di diversi RNA
RNA polimerasi I: RNA ribosomiali 28S, 5.8S e 18S (GENI NON CODIFICANTI) RNA polimerasi II: Geni codificanti proteine (mRNA), geni per la maggior parte dei piccoli RNA nucleari (snRNA), geni per microRNA e RNA delle telomerasi RNA polimerasi III: RNA transfer, RNA ribosomiali 5S, alcuni piccoli RNA nucleari e piccoli RNA citoplasmatici (scRNA) (GENI NON CODIFICANTI)

28 Confronto tra le subunità delle RNA polimerasi di lievito e di E. coli
2 subunità grandi (omologhe a subunità β e β’ di RNA polimerasi batterica); 2 subunità piccole (omologhe a subunità a di RNA polimerasi batterica); queste 4 subunità si associano a formare un core polimerasico; a questo core si associano da 10 a 13 altre subunità (alcune comuni a tutte e tre le RNA polimerasi e alcune specifiche per ogni singola RNA polimerasi).

29 Complesso di inizio della trascrizione di RNA polimerasi II
L’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi II (Pol II) richiede fattori di trascrizione generici (TFII), che posizionano Pol II a livello dei siti di inizio e sono richiesti per la trascrizione della maggior parte dei geni trascritti da questa polimerasi I fattori generici di trascrizione sono proteine multimeriche altamente conservate Le proteine che fanno parte del complesso di inizio trascrizione di Pol II si assemblano in un ordine preciso in vitro

30 TATA box è una sequenza altamente conservata dei promotori eucariotici

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33 La trascrizione da parte della RNA-polimerasi II è regolata da sequenze regolatrici e, spesso, stimolata da siti “intensificatori” (enhancers) anche molto distanti, o arrestata da silenziatori (repressori)

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35 L’inizio della trascrizione da parte delle RNA polimerasi I e III è analogo a quello della RNA- polimerasi II Tipico aspetto ad “albero di Natale” dei trascritti di RNA nascenti di diversa lunghezza

36 Le tre RNA-polimerasi eucariotiche utilizzano diversi meccanismi di terminazione
L’RNA polimerasi I termina la trascrizione con un meccanismo che richiede un fattore di terminazione specifico, che si lega a valle dell’unità di trascrizione L’RNA polimerasi III termina la trascrizione dopo la polimerizzazione di una serie di U L’RNA polimerasi II termina la trascrizione in una regione kb oltre il sito di aggiunta della coda di poli-A, e la terminazione è accoppiata col processo che taglia e poliadenila l’estremità 3’ del trascritto

37 I pre-mRNA vengono tagliati a livello di specifici siti vicini al terminale e vengono rapidamente poliadenilati (facilita l’esportazione dell’mRNA dal nucleo e ne aumenta la stabilità)

38 I trascritti primari eucariotici per gli mRNA (pre-mRNA) sono modificati per aggiunta di un “cappuccio” metilato al 5’ che facilita il legame al ribosoma dell’mRNA e lo protegge dalla degradazione ad opera delle ribonucleasi

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40 Durante l’ultima fase della maturazione degli mRNA, gli introni sono rimossi e gli esoni sono montati assieme: SPLICING Il processo che porta all’eliminazione degli introni dal trascritto primario, e alla ricongiunzione degli esoni, è noto come “splicing” o “montaggio”, per analogia col processo con cui da una pellicola cinematografica vengono eliminati alcuni fotogrammi per conservarne altri ripristinando la continuità della pellicola.

41 Lo splicing avviene a livello di brevi sequenze consenso molto conservate

42 Lo “spliceosoma” è un complesso ribonucleoproteico composto di diverse particelle snRNPs

43 Possibili conseguenze da splicing errato
Es. -talassemia taglio non corretto del pre-mRNA causato da mutazione genica  quantità insufficiente di -globina dell’emoglobina

44 Splicing alternativo: sistema con il quale dallo stesso gene si possono ottenere diversi mRNA
Es. tropomiosina nei mammiferi (stesso gene ma diversi tagli in diversi tessuti, diverse forme di tropomiosina nel muscolo liscio, nel muscolo scheletrico, nei fibroblasti, nel fegato e nel cervello) n° mRNA > n° geni

45 Tappe fondamentali della “maturazione” degli mRNA negli eucarioti
INCAPPUCCIAMENTO (CAPPING) ALL’ESTREMITA’ 5’ TAGLIO DEL TRASCRITTO E POLIADENILAZIONE ALL’ESTREMITA’ 3 Esone Introne Esone Introne Esone DNA Cappuccio Trascrizione Aggiunta del cappuccio e della coda RNA trascritto con cappuccio e coda Gli introni vengono rimossi Coda Gli esoni si legano tra loro mRNA Sequenza codificante Nucleo Citoplasma MONTAGGIO (SPLICING), OSSIA ELIMINAZIONE DEGLI INTRONI E RISALDATURA DEGLI ESONI EDITING CIOE’ AGGIUNTA DI NUCLEOTIDI NON TRASCRITTI E MODIFICAZIONI DI BASI TUTTE QUESTE MODIFICAZIONI AVVENGONO NEL NUCLEO

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49 IL CODICE GENETICO ovvero
come tradurre una sequenza di nucleotidi in una sequenza di aminoacidi

50 IN TUTTE LE CELLULE, LA SINTESI DELLE PROTEINE E’ DIRETTA DAL DNA
IN CHE MODO SI REALIZZA CIO’ ? ovvero: QUALE E’ LA “REGOLA” CHE FA CORRISPONDERE A UNA SEQUENZA DI NUCLEOTIDI NEL DNA (E DOPO LA TRASCRIZIONE, NELL’mRNA), UNA SEQUENZA DI AMINOACIDI NELLE PROTEINE ? CON QUALE MECCANISMO BIOCHIMICO SI SVOLGE TALE “TRADUZIONE” DA RNA A PROTEINE?

51 Basandosi su un semplice calcolo matematico, poiché i diversi nucleotidi sono solo 4, e quindi un solo nucleotide non può codificare in modo non ambiguo 20 aminoacidi, e neppure tutte le possibili sequenze di due nucleotidi (42=16) sarebbero sufficienti, propone l’ipotesi che le “parole in codice”, scritte sotto forma di sequenze di nucleotidi nel DNA, siano costituite da “triplette” (sequenze di tre nucleotidi, 43=64).

52 IL CODICE GENETICO E’ COSTITUITO DA
PAROLE FORMATE DA TRE NUCLEOTIDI

53 INIZIA LA DECIFRAZIONE DEL CODICE GENETICO
Utilizzano estratti batterici contenenti tutti i componenti necessari per la sintesi proteica (aminoacil-tRNA, ribosomi, ATP, etc.) in vitro, eccetto l’mRNA: questo viene sostituito da polinucleotidi sintetici formati da polimeri di un solo tipo di nucleotide, ossia: poli-U, poli-A, poli-C e poli-G

54 Ottengono così polipeptidi formati dallo stesso aminoacido ripetuto, giungendo così alla decifrazione delle prime quattro parole del codice genetico: UUU= Fenilalanina (Phe) AAA= Lisina (Lys) CCC= Prolina (Pro) GGG= Glicina (Gly)

55 1963-68: CONTINUA LA DECIFRAZIONE DEL CODICE GENETICO

56 IL CODICE GENETICO DECIFRATO

57 IL CODICE GENETICO E’ DEGENERATO
Il codice genetico è formato da parole di tre nucleotidi (triplette o “codon”), ma le parole del codice sono molte di più (43 = 64) dei 20 diversi amminoacidi che devono specificare: si trattava però di verificare se molte di queste «parole in codice» fossero prive di significato oppure se tutte avessero un significato. La maggior parte dei codoni ha un significato, il che equivale a dire che diversi codoni hanno lo stesso significato, cioè specificano per lo stesso aminoacido. Soltanto 3 dei 64 codoni, non corrispondono a nessun amminoacido e determinano invece l’interruzione della sintesi proteica. Essi sono perciò chiamati codon non senso oppure codon di STOP: UGA, UAG e UAA

58 IL CODICE GENETICO NON E’ AMBIGUO
ovvero AD OGNI PAROLA IN CODICE (TRIPLETTA O “CODON”) CORRISPONDE UN SOLO AMMINOACIDO

59 IL CODICE GENETICO E’ SENZA VIRGOLE
Altri esperimenti furono necessari per verificare che: IN UNA SEQUENZA CODIFICANTE OGNI NUCLEOTIDE FA PARTE DI UN CODONE ovvero: IL CODICE GENETICO E’ SENZA VIRGOLE e inoltre IN UNA SEQUENZA CODIFICANTE OGNI NUCLEOTIDE FA PARTE DI UN SOLO CODONE ovvero: IL CODICE GENETICO NON E’ SOVRAPPOSTO

60 IL CODICE GENETICO E’ UNIVERSALE
Ma,soprattutto: IL CODICE GENETICO E’ UNIVERSALE cioè con pochissime eccezioni, tutti gli organismi viventi utilizzano lo stesso codice genetico !

61 LE MUTAZIONI

62 Da che cosa sono causate le mutazioni?
Un certo numero di errori durante la replicazione del DNA avviene spontaneamente. Agenti fisici (ad es. raggi X o UV) Agenti mutageni chimici Il tasso di mutazione può essere enormemente aumentato dall’esposizione ad agenti mutageni I mutageni chimici sono molecole che si combinano con il DNA oppure causano cambiamenti chimici nelle basi nucleotidiche oppure sono simili alle basi nucleotidiche e vengono incorporate al loro posto causando però errori di appaiamento

63 Mutazioni cromosomiche
numero dei cromosomi struttura

64 Mutazioni geniche Sostituzione Delezione Inserzione
Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un’altra Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o all’inserzione di una base nel filamento del DNA Sostituzione Delezione Inserzione

65 Sostituzione di una base nucleotidica con un’altra
La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi: mutazioni silenti mutazioni di senso mutazioni non senso

66 Mutazioni silenti. Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa Fino a quattro diverse triplette specificano lo stesso aminoacido (il codice genetico è degenerato) Le sostituzioni silenti riguardano la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido

67 CCU GCU Prolina Alanina
Mutazioni di senso. Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido CCU GCU Prolina Alanina La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido

68 La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l’aminoacido sostituito e il nuovo, e dalla posizione della sostituzione. Es. La sequenza dell’emoglobina dell’uomo, del maiale, del cane o del cavallo differisce per parecchi aminoacidi e pur tuttavia tutte queste emoglobine svolgono la funzione in modo efficiente. D’altra parte una singola sostituzione (la valina al posto di glutammato in posizione 6) che si ha nell’anemia falciforme porta alla completa non funzionalità e alla morte del soggetto (eritrociti con forma anomala in seguito alla formazione di aggregati della catena  dell’emoglobina)

69 AAG UAG Lisina Codone di stop
Mutazioni nonsenso. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione) AAG UAG Lisina Codone di stop Nella fibrosi cistica, in seguito ad una mutazione nonsenso e conseguente introduzione di un codone di stop, una proteina che trasporta il Cl- attraverso la membrana citoplasmatica non funziona correttamente.

70 Delezione o inserzione di una base
(mutazioni per spostamento della griglia di lettura) Talvolta l’errore consiste nell’inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base. In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata A (inserzione) A U G A G G A C U C C C G G A U U A Met Arg Thr Pro Gly Leu A U G A G G A A C U C C C G G A U U A Asp Ser Arg Iso