TECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHE

Presentazione sul tema: "TECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHE"— Transcript della presentazione:

1 TECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHE
Il passaggio della luce o di radiazioni elettromagnetiche attraverso Una sostanza Informazioni qualitative Informazioni quantitative INTERAZIONE tra una radiazione elettromagnetica e la MATERIA FENOMENO QUANTICO

2 PARAMETRI CHE LE CARATTERIZZANO
Le radiazioni sono onde elettromagnetiche che viaggiano alla velocità di 3x108 m/sec. PARAMETRI CHE LE CARATTERIZZANO l = lunghezza d’onda distanza tra due stessi punti dell’onda elettromagnetica (si misura in METRI) = frequenza numero di oscillazioni compiute nell’unità di tempo (si misura in Hertz; 1 Hz = 1 ciclo/sec) E = energia o intensità di una radiazione elettromagnetica

3 La lunghezza d’onda ( l ) e la sua frequenza ( n ) sono grandezze tra loro inversamente proporzionali: l n = C C = la velocità di propagazione dipende dal mezzo ed è massima nel vuoto Il suo valore è di circa 3 x 108 m/sec Per una qualsiasi radiazione è necessario conoscere solo uno dei due parametri per poter ricavare anche l’altro. E = n l Radiazioni a bassa lunghezza d’onda e ad elevata frequenza: elevata energia Elevata lunghezza d’onda ed bassa frequenza: bassa energia

4 SPETTRO DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE
Lunghezza d’onda Lunghezza d’onda E' evidente, dalla scala rappresentata in figura, che le radiazioni elettromagnetiche che il nostro occhio riesce a percepire (visibile) sono comprese in una banda molto ristretta (riusciamo cioè a "vedere" solo una piccolissima parte dello spettro elettromagnetico); ma anche tutte le altre radiazioni, suddivise in bande, ci sono e possono interagire in modo diverso con la materia.  SPETTRO DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE Nella regione del VISIBILE: radiazioni che possono essere percepite dall’occhio umano Radiazioni a bassa lunghezza d’onda e ad elevata frequenza: elevata energia Elevata lunghezza d’onda ed a bassa frequenza: bassa energia

5 λ > Bassa Energia Le radiazioni elettromagnetiche che riusciamo a "vedere" sono solo una piccolissima parte dello spettro elettromagnetico

6 Come avviene l’interazione tra le radiazioni elettromagnetiche e la materia ?
L’interazione della materia con la radiazione elettromagnetica dipende dalle proprietà chimiche e fisiche della materia. * Il fenomeno si basa sulla teoria quantistica della materia Gli elettroni presenti in un orbitale atomico o molecolare si distribuiscono secondo unità discrete di energia o quanti E eccitato Eo fondamentale DE = frequenza L’interazione della materia con la radiazione elettromagnetica dipende dalle proprietà chimiche e fisiche della materia. L’energia associata al passaggio dallo stato fondamentale Eo a quello eccitato avviene solo se è di una particolare frequenza o lunghezza d’onda

7 Interazioni tra una radiazione elettromagnetica e la materia
SI VERIFICANO TRANSIZIONI ELETTRONICHE associabili ALLE DIVERSE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE La radiazione incidente provoca transizioni elettroniche con assorbimento della radiazione: questo tipo di interazione è utilizzata dalle tecniche spettroscopiche La radiazione incidente è associata ad un processo interno che causa emissione di radiazione: questo tipo di interazione è utilizzata nella spettroscopia di luminescenza

8 La spettroscopia atomica o molecolare
in seguito a transizioni che si verificano a livello atomico e molecolare Considera l’energia delle radiazioni elettromagnetiche che viene assorbita: SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO Oppure quella parte dell’energia delle radiazioni elettromagnetiche che viene emessa: SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE

9 Sulla base delle diverse radiazioni elettromagnetiche avremo:
spettroscopia rotazionale (onde radio) spettroscopia vibrazionale (infrarosso) spettroscopia molecolare (visibile e ultravioletto) spettroscopia atomica (raggi X)

10 SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO
LA TECNICA SPETTROSCOPICA CONSENTE AI CHIMICI DI OTTENERE INFORMAZIONI QUALI-QUANTITATIVE Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo scambio di energia che si verifica fra l’energia radiante e la materia SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del visibile (350 –750 nm) e del vicino ultravioletto (200–350 nm)

11 I0 = IR + IA + IT I0 = IA + IT SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO
Quando una radiazione elettromagnetica attraversa una sostanza, provocherà una transizione elettronica e la radiazione emergente dalla sostanza avrà una intensità più bassa I0 = Intensità radiazione incidente IR = “ “ riflessa IA = “ “ assorbita IT = “ “ trasmessa I0 = IR + IA + IT Nelle soluzioni: I0 = IA + IT IL SOLUTO è responsabile dell’assorbimento

12 It I0 = 10-ecl LA LEGGE DI LAMBERT-BEER l = il cammino ottico (cm) c = concentrazione molare del soluto e = coefficiente di estinzione molare, specifico per ogni sostanza ma il log I0 / I t = e c l E = e c l E= Densità ottica o ASSORBANZA è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce

13 e = coefficiente di estinsione molare
Rappresenta quella densità ottica di una soluzione in cui la concentrazione = 1 (c = 1) ed il cammino ottico è unitario (l = 1) It I0 = 10-ecl E = εc l La legge di Lambert-Beer consente di calcolare facilmente la concentrazione di una soluzione dalla misura dell’intensità della radiazione trasmessa It quando è nota: l’intensità della luce incidente I0 , e ed il cammino ottico (l)

14 T = TRASMISSIONE PERCENTUALE
T = 100 It Io T = TRASMISSIONE PERCENTUALE Log T = 2 - log Io / It Log T = 2 - E E = 2 - log T T = 1 sostanza trasparente E = 0 T = 0 sostanza opaca E = ∞ T varia da 0 a 100 E varia da + ∞ a 0 E = 2 – log T

15 Spettrofotometri UV-VISIBILE, i tipi più comuni sono il “monoraggio” e il “doppio raggio”:
1) SORGENTE DI RADIAZIONE 2) SELEZIONATORE DI LUNGHEZZE D’ONDA: MONOCROMATORE 3) CELLA o Cuvetta (contenitore campione) 4) RIVELATORE 5) LETTORE

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17 Sorgenti di radiazioni per spettroscopia nel visibile ed ultravioletto
Ad incandescenza (compresa tra nm) adatta solo per il visibile Ad idrogeno (compresa tra nm) adatta solo per ultravioletto

18 MONOCROMATORE Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate in successione sul campione. ELEMENTO DISPERDENTE Prisma o Reticolo separa i componenti della radiazione permette la successiva selezione della banda desiderata

19 CUVETTE Sono i contenitori dei campioni da analizzare Cammino ottico calibrato (1cm) Volume diverso Materiale diverso: Quarzo per UV e visibile Vetro o plastica solo per il visibile

20 PORTACUVETTE dove inserire il campione

21 Rielaborazione e presentazione dei dati
RILEVATORI dispositivi capaci di produrre un segnale elettrico relativo all'energia della radiazioni ricevuta. Rielaborazione e presentazione dei dati un convertitore digitale fornisce i risultati dell’analisi direttamente su un personal computer che ne elabora i dati Il lettore converte il segnale elettrico proveniente dal rivelatore in un valore numerico proporzionale all’intensità del segnale. ASSORBANZA

22 SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO,
usati prevalentemente in analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di assorbimento per ogni misura, si deve ripetere l'azzeramento contro il bianco Converte l’Intensità della radiazione in Intensità di corrente IL MONOCROMATORE è un PRISMA o un RETICOLO DI DIFFRAZIONE 1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura l’Intensità. 2) Si lava la cuvetta. 3) Si mette la soluzione e si misura l’intensità. 4) Si fa il rapporto fra le due Intensità

23 è possibile effettuare misure direttamente senza ripetere azzeramenti
SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO: un sistema invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. è possibile effettuare misure direttamente senza ripetere azzeramenti Il bianco (o riferimento) è costituito dal solvente ad eccezione della sostanza di cui si vuol esaminare l’assorbimento La radiazione proveniente dal MONOCROMATORE si divide in due raggi che sono inviati contemporaneamente al campione ed al solvente. Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con l’Intensità trasmessa Icampione Il computer registra entrambe in modo alterno e calcola il rapporto.

24 Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio

25 L’assorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanza
E = 2-log (T) E = e cl Secondo la legge di Lambert–Beer l’assorbanza E è proporzionale alla concentrazione del soluto, per cui più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l’assorbanza

26 FOTOMETRIA I valori di T sono convertiti in E o assorbanza (A)
Per risalire dai valori di E alla concentrazione della soluzione in esame : Noto il coefficiente di estinsione molare: e Noto il cammino ottico: l Si allestisce una CURVA STANDARD di una soluzione a concentrazione nota

27 Concentrazione albumina mg
Conoscendo il valore dell’assorbanza del campione si può interpolare graficamente il valore della sua concentrazione su di una retta di taratura 1,25 1,00 . 0,75 Assorbanza 280nm 0,50 0,25 0’5 1,0 1,5 2,0 2,5 Concentrazione albumina mg

28 METODI COLORIMETRICI PER IL DOSAGGIO DELLE PROTEINE
METODO DI LOWRY: Il metodo si basa sulla REAZIONE DEL BIURETO : - i legami peptidici reagiscono con gli ioni Cu2+ del reagente di Folin-Ciocalteau, si sviluppa un colore BLU-PORPORA proporzionale alla concentrazione delle proteine, si misura l’assorbanza a 660 nm METODO DI BRADFORD Il colorante Coomasie Blue forma composti colorati in "blu" con le proteine, tramite legami elettrostatici proteina-gruppi sulfonici del colorante in soluzione acida. Quando è legato alla proteina ha un massimo a 595 nm. Stabile da 5’ ad 1 hr

29 Il massimo dell’assorbimento dipende dai gruppi funzionali presenti nelle molecole ed identifica LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza (SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizzato A SCOPO ANALITICO

30 ASSORBIMENTO DELLA LUCE ULTRAVIOLETTA DA PARTE DEGLI Aa AROMATICI
Il triptofano e la tirosina Assorbono la luce ultravioletta, ciò spiega perché la maggior parte delle proteine hanno un caratteristico assorbimento della luce ad una lunghezza d’onda di 280nm

31 DETERMINAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DELLA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINE
1) Misura dell’assorbimento della luce nell’ultravioletto

32 260nm

33 essere distinti in base agli spettri di assorbimento della luce
LUNGHEZZA D’ONDA I citocromi possono essere distinti in base agli spettri di assorbimento della luce

34 Dosaggio degli acidi nucleici
Metodo spettrofotometrico (spettroscopia nell’ultravioletto) Metodo fluorimetrico Metodo colorimetrico (spettroscopia nel visibile)

35 SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO
assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del visibile (350 –700 nm) e del vicino ultravioletto (200–350 nm) METODI DIRETTI Sfruttano le proprietà ottiche delle molecole analizzate PROTEINE = 280 nm ACIDI NUCLEICI = 260 nm METODI INDIRETTI

36 COME DETERMINARE LA PUREZZA E LA CONCENTRAZIONE DI UN ACIDO NUCLEICO
lettura spettrofotometrica a 260nm 1 OD = 50 mg/ml di DNA 1 OD = 40 mg/ml di RNA Il rapporto tra le OD misurate a 260 nm e 280 nm fornisce una indicazione della purezza dell’acido nucleico esaminato Una soluzione di DNA o RNA puro dovrebbe avere un rapporto A260/A280 di 1,8 - 2,0 NOTA. Un picco di assorbimento a 270nm indica presenza di fenolo, eliminabile con un lavaggio con etere etilico

37 Spettro di assorbimento del DNA
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280 tra 1,8 e 2,0

38 Prelevare 5μl del campione di DNA e diluirli 200 volte: 5μl 1000 μl
Per stabilire la purezza………… Lettura spettrofotometrica del campione diluito A260/A280 = 1,8 Sappiamo che 50 μg di DNA a 260nm ha un valore di assorbanza pari a 0.5 Per stabilire la concentrazione………… 50 μg : 1.00 OD= X μg : 0.5 OD X μg = 0.5x 50 μg / 1.00 Il valore ottenuto deve poi essere moltiplicato per 200 per ottenere la reale concentrazione del campione espressa in μg/ml

39 Metodo fluorimetrico Quantità crescenti di acido nucleico a concentrazione nota su un gel di agarosio accanto al campione a concentrazione incognita Corsa elettroforetica e colorazione con etidio bromuro Costruzione di una retta di taratura: in ascissa la concentrazione nota dei vari Campioni, in ordinata la fluorescenza determinata ad es. con un densitometro L’intensità di fluorescenza è proporzionale alla quantità di ac. nucleico, per interpolazione sulla retta di taratura si risale alla concentrazione incognita

40 Metodo colorimetrico Difenilammina (DFA) per il DNA - reazione specifica Forma un complesso di colore celeste in ambiente acido Lettura delle OD allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 595nm Saggio con l'orcinolo per il dosaggio dell'RNA Forma un complesso verde-azzurro Lettura delle OD allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 660nm

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42 APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA
Analisi quantitatitiva: Misura della concentrazione di molecole che assorbono la luce come le proteine e gli acidi nucleici Studio delle interazioni delle macromolecole (DNA o proteine) con ligandi o altre macromolecole Studio delle cinetiche di reazione (cinetica enzimatica) Analisi qualitativa: identificazione di classi di composti, sia in forma pura che in preparati biologici. Identificazione di intermedi di reazione.

43 Spettri di assorbimento di varie forme dell’EMOGLOBINA
Assorbanza Lunghezza d’onda (nm)

44 P + L  P•L Esempio di studio delle interazioni
PUNTI ISOSBESTICI Esempio di studio delle interazioni tra una macromolecola (P) ed un ligando (L) Esempio di studio di una cinetica di reazione CH3-CH2-OH CH3-CHO NAD NADH

45 Applicazioni METODI DIRETTI METODI INDIRETTI
Amminoacidi = ninidrina (570nm) Proteine = biureto (540) Zuccheri = proprietà riducenti Enzimi = substrati o prodotti

46 METODI DI DOSAGGIO DEL GLUCOSIO
Metodi enzimatici indiretti Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene utilizzato come substrato in un’altra reazione nella quale è coinvolta una sostanza cromofora Glucosio + O2 + H2O → Ac. Gluconico + H2O2 Glucosio ossidasi H2O2 + cromogeno ridotto → cromogeno ossidato + H2O Perossidasi Glucosio-6P + NADP → 6P-gluconato + NADPH Glucosio + ATP → Glucosio-6P + ADP esochinasi

47 La riduzione dell’anello nicotinamidico produce una nuova banda di assorbimento della luce con un massimo a 340nm

48 SPETTROFLUORIMETRIA EMETTE ENERGIA INFERIORE A QUELLA ASSORBITA
Tecnica ottica quali-quantitativa Una molecola assorbe radiazioni nell’ultravioletto e le emette nel visibile La molecola passa dal livello energetico fondamentale ad uno stato eccitato instabile Si verifica una transizione elettronica da uno stato energetico superiore ad uno inferiore EMETTE ENERGIA INFERIORE A QUELLA ASSORBITA L’energia della radiazione emessa: avrà una frequenza inferiore e una lunghezza d’onda superiore a quella di eccitazione: “legge di Stokes” La molecola passa dal livello energetico fondamentale a uno eccitato con una transizione elettronica, dopo di che inizia a cedere energia tramite urti con altre molecole. Si verifica in seguito ad una transizione elettronica da uno stato energetico superiore ad uno inferiore Le radiazioni emesse appaiono come spettri a banda

49 Componenti principali di uno spettrofluorimetro
La radiazione emessa viene registrata da uno strumento chiamato spettrofluorimetro, il quale permette di produrre uno spettro di emissione (fluorescenza).  Il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto alla luce incidente

50 La lunghezza d'onda della radiazione emessa da una lampada
allo Xenon (l1) viene selezionata attraverso l'utilizzo di un monocromatore (M1) e viene usata per eccitare il campione posto in una cuvette. La radiazione di fluorescenza emessa dalla specie in esame (l2) viene inviata ad un fotomoltiplicatore che la amplifica e la invia all'analizzatore, il quale come output produce lo spettro.

51 La spettrofluorimetria può quindi venire utilizzata per
analisi di tipo quantitativo e qualitativo.

52 L’intensità della radiazione emessa in seguito al fenomeno
della fluorescenza può essere utilizzata a scopi quantitativi Poiché esiste la relazione A basse concentrazioni della sostanza fluorescente (fluoroforo), l’intensità della fluorescenza (If) è proporzionale alla concentrazione C è la concentrazione del fluoroforo d è il cammino ottico della luce nella soluzione fluorescente el è il coefficiente di estinzione molare del fluoroforo I0 è l’intensità della radiazione incidente Q è la RESA QUANTICA (rapporto tra energia emessa e quella assorbita)

53 La tecnica della spettrofluorimetria :
consente solo una misura relativa della fluorescenza è sensibile al pH, alla temperatura ed alla polarità del solvente risente del fenomeno dello smorzamento della fluorescenza (quenching) ha maggiore sensibilità ed accuratezza a basse concentrazioni

54 APPLICAZIONI DELLA SPETTROFLUORIMETRIA
Analisi qualitativa: Identificazione della struttura di una sostanza (confronto tra spettro di assorbimento e spettro di emissione; Analisi della struttura delle proteine (fluorescenza dei residui aromatici) Separazione di cellule tramite marcatura con anticorpi fluorescenti Dosaggi enzimatici e misure di cinetica enzimatica

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56 Analisi quantitativa:
fluorescenza intrinseca : Misura della concentrazione di molecole fluorescenti fluorescenza estrinseca: molecole non fluorescenti previa derivatizzazione con fluorofori: Cloruro di dansile (DNS) · Acido 1-anilinonaftalen-8-solfonico (ANS) · Etidio bromuro (EB) misure quantitative di molecole presenti in concentrazioni molto basse.

57 COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA
Studio morfologia nucleare: e in nucleici. In particolare colora in verde il DNA rosso l’ RNA Nell’analisi biologica si fa spesso ricorso all’utilizzo di molecole capaci di legarsi a specifiche strutture o proteine; spesso queste molecole sono coniugate (direttamente o indirettamente), con fluorocromi che consentono la visualizzazione della specifica struttura mediante emissione di un segnale fluorescente. L’arancio di acridina è un colorante fluorescente per gli acidi

58 Utilizzo di anticorpi resi fluorescenti da isocianato di fluoresceina
Nell’analisi biologica si fa spesso ricorso all’utilizzo di molecole capaci di legarsi a specifiche strutture o proteine; spesso queste molecole sono coniugate (direttamente o indirettamente), con fluorocromi che consentono la visualizzazione della specifica struttura mediante emissione di un segnale fluorescente. Utilizzo di anticorpi resi fluorescenti da isocianato di fluoresceina