La degradazione automatica di Edman

Presentazione sul tema: "La degradazione automatica di Edman"— Transcript della presentazione:

1 La degradazione automatica di Edman
Titolo del seminario con una visione del tutto 1

2 La degradazione automatica di Edman permette di identificare il residuo
N-terminale di una proteina e si basa sulla reazione messa a punto da P. Edman circa 60 anni fa con il fenilisotiocianato N C S

3 Determinazione della sequenza N-Terminale
DEGRADAZIONE DI EDMAN

4 PTH-aa standard hplc hplc

5 feniltioidantoina (PTH) Condizioni blande acide
Degradazione di Edman feniltiocarbamile (PTC) feniltioidantoina (PTH) derivato tiazolinico N H NH 3 R R' O S + Analisi tramite RP-HPLC Condizioni blande acide in acqua C 23 Condizioni basiche TFA 100% anidro idrolisi anidra conversione PITC 5

6 Restrizioni dovute alla Degradazione di Edman
Se l'amminoterminale è bloccato il peptide non può essere sequenziato con la degradazione di Edman (formilazione, piroglutammico ecc) Amminoacidi glicosilati e fosforilati possono dare "cicli bianchi", cioè con assenza di PTH-amminoacidi conosciuti Le cisteine…

7

8 I campioni devono essere:
liberi da sali, da ammine primarie e detergenti sciolti in un solvente volatile come acqua, acetonitrile o in forma liofilizzata alternativamente possono essere trasferiti con elettroblotting su membrana PVDF (polivinilidene difluoruro)

9 Utilizzo della Degradazione automatica di Edman
Determinazione della struttura primaria di una proteina Riconoscimento di proteine in modo diretto dopo cromatografie e/o elettroforesi Studio di modifiche post-traduzionali

10 La struttura primaria delle proteine
fornisce informazioni sulla funzione di proteine per omologia fornisce informazioni su residui conservati ed indispensabili per le proprietà catalitiche di enzimi fornisce informazioni per comprendere a livello molecolare malattie ereditarie e metaboliche fornisce informazioni su modifiche post-traduzionali

11 È possibile determinare la struttura primaria di un’intera proteina effettuando di seguito un numero di cicli di degradazione di Edman opportuni? NO! La reazione di Edman non presenta una resa del 100%: per ogni ciclo si accumulano prodotti secondari (si arriva al massimo a determinare una successione 50/60 aa)

12 Strategia per la determinazione dell’intera struttura primaria della proteina
Poiché la maggior parte delle proteine presenta un numero di residui maggiore di 50/60 unità, prima del sequenziamento devono essere frammentate con: Metodo enzimatico (peptidasi che permettono di ottenere peptidi di minore lunghezza, separati mediante RP-HPLC) oppure Metodo chimico (CnBr, specifico per le Met)

13 Reagente Sito di taglio
Taglio chimico Bromuro di cianogeno Lato carbossilico di residui Met O-iodobenzoato Lato carbossilico di residui Trp Idrssilammina Legami Asp-Gly 2-Nitro-5-tiocianobenzoato Lato amminico di residui di Cis Taglio enzimatico Tripsina Lato carbos. di residui Lys e Arg Clostripaina Lato carbos. di residui Arg Proteasi dello Stafilococco Lato carbos. di residui Asn e Gln

14 Principali tipi di endopeptidasi
Enzima Fonte Specificità Punti addizionali Tripsina Pancreas bovino taglia al C-terminale del legame peptidico di R e K, ma non se seguiti da P. alta specificità per i residui con carica positiva. Chimotripsina taglia al C-terminale del legame peptidico di F, Y, W, ma non se seguiti da P. preferisce voluminosi residui idrofobici; taglia lentamente anche a N, H, M e L. Thermolisina Bacillus thermoproteolyticus taglia all’N-terminale di I, M, F, W, Y, V ma non se seguiti da una P preferisce residui piccoli e neutri; può tagliare anche a A, D, H e T. Asp-N Proteina ingegnerizzata da Pseudomonas fragi taglia all’N-terminale del legame peptidico di D e dell’acido cisteico. provoca tagli addizionali in corrispondenza dei residui di E. Endopeptidasi V8 Staphylococcus aureus taglia al C-terminale del legame peptidico di E e di D. la specificità per D o E può variare con l’utilizzo di tamponi differenti.

15 Rappresentazione schematica della determinazione della sequenza di una proteina: il procedimento della sovrapposizione

16 Sequenza della catena A della Volkensina, una Ribosome Inactivating Proteins, estratta dalle radici di Adenia volkensii. Chambery A. et al., Eur J Biochem Jan;271(1):

17 Utilizzo della Degradazione automatica di Edman
Determinazione della struttura primaria di una proteina; Riconoscimento di proteine in modo diretto dopo cromatografie e/o elettroforesi;

18 Riconoscimento in modo diretto dopo cromatografie e/o elettroforesi
di proteine separate mediante un passaggio di purificazione a seguito del quale la proteina risulta pura; di proteine non pure ma separabili tramite SDS-PAGE e successivo elettroblotting; di proteine separate tramite 2D-PAGE e successivo elettroblotting;

19 Determinazione della sequenza N-terminale di una proteina dopo
SDS-PAGE Proteina Sequenza N-terminale mediante degradazione di Edman Separazione elettroforetica mediante SDS-PAGE Elettroblotting e colorazione con Rosso Ponceau

20 Informazioni di sequenza immediatamente dopo 2D-PAGE e elettroblotting
Peso molecolare Elettroblot su apposita membrana pH Taglio dello spot Sequenziatore di proteine

21 Sensibilità : >250 fmoli (….) Tempo: informazioni in 15 ore.
In alcuni casi si possono determinare anche aa. Identificazione con analisi in banche dati. Blast, Tblast, Fasta and TFASTa Numero minimo di amminoacidi utili per l’analisi: 10/15 Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi| |sp|O42897|PSD3_SCHPO PROBABLE 26S PROTEASOME REG gi| |ref|NP_ | gp52 [Bacteriophage phi-C31] >g gi| |sp|P75153|Y43C_MYCPN HYPOTHETICAL LIPOPROTEIN MG gi| |pir||G01747 albumin homolog - human (fragment) > gi| |gb|AAD |AF119821_1 (AF119821) attractin [M gi| |ref|NP_ | attractin; attractin (with dipe gi| |emb|CAB | (AL132773) dJ741H3.1.1 (attracti gi| |dbj|BAB | (AB038388) attractin [Rattus no gi| |gb|AAF |AAF72882 (AF218915) secreted attra gi| |emb|CAB | (AL132773) dJ741H3.1.2 (KIAA gi| |gb|AAD | (AF106861) attractin-2 [Homo sapi gi| |ref|NP_ | attractin [Mus musculus] >gi| gi| |ref|XP_ | attractin [Homo sapiens] gi| |dbj|BAB | (AB038387) attractin [Rattus no gi| |gb|AAF |AAF72881 (AF218915) membrane attra gi| |emb|CAB | (AL121965) dJ161I14.1 (RNA helic gi| |gb|AAG | (AY013288) ASC-1 complex subunit gi| |emb|CAA | (AJ223948) RNA helicase [Homo sa gi| |ref|XP_ | albumin precursor [Homo sapiens] gi|28590|emb|CAA | (V00494) reading frame HSA [Homo s gi| |gb|AAF |AF190168_1 (AF190168) serum albumi gi|28592|emb|CAA | (V00495) serum albumin [Homo sapiens] gi| |sp|P77892|SYGA_MORCA GLYCYL-TRNA SYNTHETASE ALPH gi| |ref|NP_ | albumin precursor; PRO0883 prot gi| |pir||T05076 hypothetical protein T6K Arab 6 aa >100 proteine DAHKSE Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi| |pir||G01747 albumin homolog - human (fragment) > gi| |gb|AAF |AF190168_1 (AF190168) serum albumi gi|28590|emb|CAA | (V00494) reading frame HSA [Homo s gi| |ref|NP_ | albumin precursor; PRO0883 prot gi|28592|emb|CAA | (V00495) serum albumin [Homo sapiens] gi| |ref|XP_ | albumin precursor [Homo sapiens] gi|178345|gb|AAA | (M12523) alloalbumin Venezia [Homo gi| |pdb|1E7E|A Chain A, Human Serum Albumin Complex gi|229552|prf||754920A albumin [Bos taurus] gi|418694|pir||ABBOS serum albumin precursor [validated] gi|113580|sp|P02770|ALBU_RAT SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi| gi| |emb|CAA | (X58989) serum albumin [Bos taur gi| |sp|P02769|ALBU_BOVIN SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi gi|113582|sp|P14639|ALBU_SHEEP SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi| gi| |sp|Q28522|ALBU_MACMU SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi gi|543794|sp|P35747|ALBU_HORSE SERUM ALBUMIN PRECURSOR >gi| 11 aa DAHKSEVAHR

22 Prima proteina sequenziata
Sanger F., Tuppy H. (1951) “The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates.” Biochem. J. 49: Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-amminoacidi uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi a-amminici e i gruppi a-carbossilici