CROMATOGRAFIA PER SCAMBIO IONICO

Presentazione sul tema: "CROMATOGRAFIA PER SCAMBIO IONICO"— Transcript della presentazione:

1 CROMATOGRAFIA PER SCAMBIO IONICO
Le molecole cariche interagiscono con dei gruppi funzionali che si trovano sulla fase stazionaria La forza del legame proteina-matrice dipende dalla carica netta della proteina La separazione delle molecole si basa sulle differenze di carica netta (per valori di pH definiti) delle diverse proteine FASE STAZIONARIA solida – gruppi carichi FASE MOBILE liquida Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa, destrano ed agarosio

2 Effetti del pH sulla PROTEINA
pI = 5.5 Proteinan+ Proteinan- 4 7 10 pH

3 Effetti del pH sulla PROTEINA
pI = 8.5 Proteinan+ Proteinan- 4 7 10 pH

4 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
Proteine cariche si legano alla superficie di RESINE dotate di GRUPPI IONICI di carica opposta Scambio cationico Scambio anionico Lo scambiatore cationico contiene delle cariche negative e i cationi sono attratti elettrostaticamente Lo scambiatore anionico contiene dei gruppi carichi positivamente in grado di legare ioni di carica negativa

5 Effetti del pH sulla resina scambiatrice
Gruppo CARBOSSIMETILICO scambiatore debole di cationi (ridotto intervallo di utilizzo) R-CH2-COOH = R-CH2-COO- pKa ~ 4.5 Gruppo PROPILSOLFONICO scambiatore forte di cationi (ampio intervallo di utilizzo) R-CH2-CH2-CH2-SO3H = R-CH2-CH2-CH2-SO3- pKa < 1

6 Effetti del pH sulla resina scambiatrice
Gruppo amminico terziario scambiatore debole di anioni (ridotto intervallo di utilizzo) R R | | R-CH2-N: = R-CH2-NH+ pKa ~ 8.5 Gruppo amminico quaternario scambiatore forte di anioni (ampio intervallo di utilizzo) R | R-CH2-N+-R

7 Cromatografia in Batch
- - - - - - - -

8 Proteine con carica + Proteine con carica -

9 - Scambiatore - Proteine con carica + Proteine con carica -

10 - - - - - - - - - - Scambiatore Proteine con carica +

11 CENTRIFUGAZIONE - - Scambiatore Proteine con carica +

12 soluzione di lavaggio - - - - - - - - -

13 Soluzione salina concentrata
- - - - - - - - -

14 Eluizione - - - - - - - -

15 _ _ _ _ _ _ + R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO- + R-CH2-COO-

16 Na+ Cl- Na+ Cl- Na+ Cl- R-CH2-COO- + Cl- Na+ R-CH2-COO- Na+ R-CH2-COO- Na+ + Cl- R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO-

17 Na+ Na+ Cl- Na+ Cl- Na+ Na+ R-CH2-COO- R-CH2-COO- Na+ Cl- Na+ R-CH2-COO- Na+ Cl- Cl- R-CH2-COO- Na+ Cl- Cl- Cl- + R-CH2-COO- Na+ R-CH2-COO- Na+ Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Na+ Na+ Na+ Cl- Cl-

18 Cromatografia in Batch
- - - - - - - -

19 Cromatografia su COLONNA

20 Eluizione a STEP

21 Eluizione a STEP [SALE]

22 Eluizione in gradiente
[SALE]

23 TampB TampA Pompa peristaltica Colonna Formatore di gradiente
Collettore di frazioni

24 TampB TampA Pompa peristaltica Colonna Formatore di gradiente
Collettore di frazioni

25 TampB Pompa peristaltica Colonna Formatore di gradiente
Collettore di frazioni

26 SCAMBIO IONICO VANTAGGI: Grande capacità di carico (grandi volumi)
La proteina è eluita in un volume piccolo Limitata a molecole ionizzabili SVANTAGGI: Limitata a molecole ionizzabili Esecuzione in due tempi Eluizione in un tampone a pH e forza ionica diverso dal tampone iniziale

27 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO PER SEPAPARE AMMINOACIDI
Scambiatore cationico forte pH 1-2 (tutti gli aa si legano) Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica: aa acidi (es aspartato e glutammato) aa neutri (es glicina e valina) aa basici (es lisina e arginina) Rivelazione tramite ninidrina

28 Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly
COMPOSIZIONE IN AA Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly 110°C per 24h sotto vuoto in presenza di acido cloridrico 6M Idrolisi totale della proteina Asparagina e glutammina sono convertite nei rispettivi acidi cromatografia a scambio ionico eluzione in funzione del pH

29 RESINA: Scambiatore cationico forte
pH 1-2 (tutti gli aa si legano) Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica: aa acidi (es aspartato e glutammato) aa neutri (es glicina e valina) aa basici (es lisina e arginina) Rivelazione tramite ninidrina

30 La Ninidrina reagisce con gli amminoacidi presenti nell'eluato, formando un composto colorato L'intensità del composto colorato è direttamente proporzionale alla quantità di amminoacido presente Il tempo di ritenzione del picco identifica l'amminoacido dal punto di vista qualitativo, mentre l'area dello stesso è utilizzata per ricavarne la concentrazione Per ottenere un'accurata analisi, il sistema deve essere calibrato con una miscela di amminoacidi standard, da cui ricavare successivamente i dati relativi al campione