III ESERCITAZIONE: PURIFICAZIONE DI IgG da una miscela proteica.

Presentazione sul tema: "III ESERCITAZIONE: PURIFICAZIONE DI IgG da una miscela proteica."— Transcript della presentazione:

1 III ESERCITAZIONE: PURIFICAZIONE DI IgG da una miscela proteica

2 Cellule eucariotiche contenenti IgG
Lisi mediante detergenti Omogenato cellulare Centrifugazione (eliminazione detriti cellulari) Sopranatante dell’omogenato cellulare contenente le IgG

3 Cromatografia per immunoprecipitazione
Sopranatante dell’omogenato cellulare Cromatografia per immunoprecipitazione Resina: proteina A-sefarosio

4 Volume della resina: circa 60 µl
CONDIZIONI SPERIMENTALI Volume della resina: circa 60 µl Tampone di equilibramento: TrisHCl 0.1 M, pH 8.0 Tampone di eluizione Gly-HCl 0.1M, pH 2.7 Campione di carico: lisato cellulare Volume del campione di carico= 0,3 ml

5 PROCEDURA SPERIMENTALE
La resina proteina A-sefarosio è incubata con il lisato cellulare, contenente l’anticorpo da purificare, per 1h, r.t. 2000 g per 5 min per raccogliere il materiale non legato. 8 lavaggi della resina con 0.2 ml di Tris-HCl 0.1 M, pH8 per allontanare tutto il materiale legato in maniera aspecifica alla resina (lettura a 280nm). Eluizione incubando la resina per 5 min con 60 µl di Gly-HCl 0.1M, pH 2.7. L’eluato è recuperato la resina per 5 min a 2000 xg.

6 IV ESERCITAZIONE Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti

7 (il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine)
Nella SDS-PAGE la velocità di migrazione è proporzionale alle dimensioni della proteina (il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine) - +

8 - +

9 (molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua)
+ TEMED (catalizzatore della reazione) GEL di POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua)

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11 Gel Separatore (Resolving) pH 8.8
Gel Impaccatore (Stacking) pH 6.8 (6% di Acrilammide) Gel Separatore (Resolving) pH 8.8 Dal 12% al 18% di Acrilammide

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18 Xilene cianolo Blu di bromofenolo

19 Xilene cianolo Blu di bromofenolo

20 Al termine della corsa elettroforetica il gel è colorato con una soluzione contenente acido acetico e blu di coomassie L’eccesso di colorante viene eliminato decolorando il gel con una soluzione di etanolo-acido acetico