M Microtubuli Motori Movimento Mitosi. Le tubuline  & , ciascuna di circa 55 kDa, sono omologhe, ma non identiche. Ciascuna lega un nucleotide.  

Presentazione sul tema: "M Microtubuli Motori Movimento Mitosi. Le tubuline  & , ciascuna di circa 55 kDa, sono omologhe, ma non identiche. Ciascuna lega un nucleotide.  "— Transcript della presentazione:

1 M Microtubuli Motori Movimento Mitosi

2 Le tubuline  & , ciascuna di circa 55 kDa, sono omologhe, ma non identiche. Ciascuna lega un nucleotide.   -tubulina lega un GTP, che non idrolizza.   -tubulina può essere legata a GTP o GDP. In certe condizioni, la  -tubulina può idrolizzare il GTP a GDP più P i, rilasciare P i, e scambiare GDP per GTP. L’eterodimero    -tubulina è l’unità strutturale di base dei microtubuli. L’eterodimero, una volta formato, non si rompe.

3 Un microtubulo è un cilindro cavo di circa 24 nm di diametro. Lungo l’asse del microtubulo, gli eterodimeri di tubulina sono legati a formare protofilamenti, con alternanza di subunità  & . 13 protofilamenti associati tra loro formano la struttura elicoidale degli eterotrimeri di tubulina nella parete del cilindro.

4 Ogni giro d’elica spazia 3 monomeri di tubulina (e.g.,  ). Ciò genera una parete in cui vi è un punto in cui, invece dei contatti laterali predominanti  & , subunità  sono adiacenti a . La microscopia elettronica di microtubuli decorati con proteine motori indica una ”elica a 3 inizi."

5 Il GTP deve essere legato sia alla subunità  che  perché un eterodimero di tubulin si associ con altri eterodimeri per formare protofilamenti o microtubuli. Durante l’assemblaggio di microtubuli in vitro, eterodimeri si legano a formare protofilamenti. Questi si associano lateralmente a formare lamine, ed eventualmente microtubuli.

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7 Gli eterodimeri possono aggiungersi o distaccarsi da ciascuna estremità di un microtubulo in vitro, ma vi è una tendenza più forte all’aggiunta di subunità all’estremitè più, dove è esposta la  -tubulina. L’aggiunta di subunità porta la  -tubulina esposta all’estremità più in contattp con l’  -tubulina. Ciò promuove l’idrolisi di GTP legato alla  -tubulina. Il P i si dissocia, ma la  -tubulina interna non può scambiare il suo GDP con GTP. Il GTP sill’  -tubulina non viene idrolizzato.

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9 PURIFICAZIONE DELLA TUBULINA La tubulina può essere purificata attraverso cicli successivi di polimerizzazione-depolimerizzazione. MT - fluorescenti MT-GFP FRAP  e  tubulina, Mg++ e GTP sono sufficienti per la polimerizzazione di microtubuli in provetta. T° - Centrifugazione

10 MICROTUBULI FLUORESCENTI CHE SI MUOVONO SU VETRINO!

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13 L’estremità meno di una subunità  può servire come GAP (GTPase activating protein) per la  - tubulina di un dimero adiacente in un protofilamento. Una proteina batterica omologa, FtsZ, 40 kD, è considerato l’antenato della tubulina. Anche FtsZ, si assembla in protofilamenti.

14 Protofilament structure has been determined at atomic resolution using cryo-EM (electron diffraction) analysis of 2-D crystals induced by treating tubulin with zinc ions in the presence of a derivative of the drug taxol. These “zinc sheets” consist of parallel arrays of protofilaments.

15 Nel protofilamento ogni nucleotide si trova all’interfaccia  - . La incapacità del GTP di dissociarsi dalla subunità  è dovuta forse alla presenza di un’ansa della subunità . Una configurazione simile spiegherebbe l’incapacità della  -tubulina nel protofilamento di scambiare GDP con GTP.

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17 I siti di legami dei nucleotidi nei motori proteici miosine e chinesine sono anch’essi strutturalmente simili a quelli di Ras. Il nucleotide si lega adiacente a una  -sheet (in magenta). Il sito di legame del nucleotide delle tubuline è strutturalmente simile al sito di legame di GTP dei membri della superfamiglia Ras.

18 Il dominio di legame del nucleotide nelle tubuline comprende una sequenza altamente conservata GGGTG(T/S)G, in nero nella figura, che è parte di una ansa + elica che si estende da una parte della beta-sheet e passa vicino ai fosfati del nucleotide.

19 COME SONO ORGANIZZATI I I MICROTUBULI?

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21 I centrosomi duplicati contribuiscono all’organizzazione del fuso mitotico.

22 The centrosome (MTOC) is usually located near the nucleus during interphase. Microtubules grow out from the MTOC, forming a hub & spoke array, even during interphase.

23 With minus ends of most microtubules anchored in the centrosome, microtubules grow & shrink mainly through addition & loss of tubulin heterodimers at their plus ends. A sub-population of microtubules with free minus ends exists in some cells. These may arise by breakage of microtubules or by release from a MTOC.

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25 INSTABILITA’ DINAMICA

26 XMAP215 E’ UBIQUITARIA

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28 MAPs (microtubule-associated proteins) are a diverse class of proteins that bind to microtubules. Binding of MAPs may be regulated by phosphorylation/ dephosphorylation.  Growth factor signal cascades activate kinases that catalyzes phosphorylation of tubulin-binding domains of MAPs. Phosphorylation causes MAPs to detach from microtubules.  Protein phosphatases that remove phosphate residues from MAPs are also regulated.

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30 Some MAPs stabilize microtubules, inhibiting depolymerization. XMAP215, a highly conserved MAP of 215 kDa molecular weight, stabilizes the plus ends of microtubules, preventing catastrophic shrinkage. Phosphorylation of XMAP215 at the onset of mitosis results in increased microtubule instability as microtubules disassemble and tubulin dimers form the mitotic spindle. Protein phosphatase activity at the end of mitosis allows greater microtubule stability as the microtubule array of interphase is reestablished.

31 MAP kinasi cdc2 kinasi LE PROTEINE MAP POSSONO ESSERE FOSFORILATE DA:

32 Catastrophe-promoting proteins (catastrophins):  Some destabilizing proteins promote catastrophe by severing microtubules, generating new ends that lack a GTP cap.  Others bind to the plus ends of microtubules and promote GTP hydrolysis. Examples:  Stathmin is a microtubule destabilizing protein that increases in abundance in some cancer cells. It is inhibited by phosphorylation.  XKCM1 is a member of the MCAK subfamily of kinesin motor proteins. XMAP215 antagonizes the microtubule destabilizing effect of XKCM1.

33 STATHMIN LEGA ETERODIMERI DI TUBULINA ED IMPEDISCE CHE VENGANO UTILIZZATI PER ALLUNGARE I MICROTUBULI. VIENE INATTIVATA DALLA FOSFORILAZIONE. Stathmin 1/oncoprotein 18, also known as STMN1, is a highly conserved 17 kDa protein. Its function as an important regulatory protein of microtubule dynamics has been well characterized. [1] Eukaryotic microtubules are one of three major components of the cell’s cytoskeleton. They are highly dynamic structures that continuously alternate between assembly and disassembly. Stathmin performs an important function in regulating rapid microtubule remodeling of the cytoskeleton in response to the cell’s needs. Microtubules are cylindrical polymers of α,β-tubulin. Their assembly is in part determined by the concentration of free tubulin in the cytoplasm. [2]highly conservedkDa proteinmicrotubule [1]cytoskeletontubulincytoplasm [2] At low concentrations of free tubulin, the growth rate at the microtubule ends is slowed and results in an increased rate of depolymerization (disassembly). [1][3] [1][3]

34 Ricercatori riferiscono della scoperta di un gene che controlla la capacità di reagire con la paura appropriata di fronte a un pericolo incombente. Come risultato, i topi privi di questo gene (statmina) diventano eccessivamente audaci e temerari. Il gene della statmina, normalmente presente ad alti livelli nell’amigdala, controlla sia le paure innate che quelle acquisite. Statmina e paura

35 Katana

36 Katanin is a microtubule severing complex (assembled of p80 and p60 subunits) named for the Japanese SamauriÕs long sword. It is a AAA protein that binds cooperatively to the microtuble wall where it can literally sever the microtubule wall. Microtubule disassembly quickly follows. Katanin activity increases (along with Stathmin/OP18 activity) during entry into mitosis and mitotic extracts cause microtubule severing in vitro.

37 KATANIN

38 Some MAPs cross-link adjacent microtubules or link microtubules to membranes or to intermediate filaments. The length of intervening segments between binding domains in particular MAPs may determine the spacing of microtubules in parallel arrays. Some examples:  Type I MAPs, in axons & dendrites of nerve cells & in some non-neural cells, have several repeats of the sequence KKEX (Lys-Lys-Glu-X) that binds to negatively charged tubulin domains.  Type II MAPs (e.g., MAP4 & Tau), in axons, dendrites & non-neural cells, have 3-4 repeats of an 18-residue sequence that binds tubulin.

39 Op 18 induce l’idrolisi del GTP della tubulina XKCM1 induce un cambio di conformazione del microtubulo

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41 XKCM1

42 XKLP

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44 ACETILAZIONE (lisine) DETIROSINAZIONE (C-term) dell’  -tubulina MODIFICAZIONI CHE RENDONO I MICROTUBULI STABILI

45 Toxins & Drugs Some toxins and drugs (all of which inhibit mitosis) affect polymerization or depolymerization of tubulin:  Taxol, an anti-cancer drug, stabilizes microtubules.  Colchicine binds tubulin & blocks polymerization. Microtubules depolymerize at high [colchicine].  Vinblastine causes depolymerization and formation of vinblastine-tubulin paracrystals.  Nocodazole causes depolymerization of microtubules.

46 CELLULA IN INTERFASE nucleo centrioli MTOC + nocodazolo - nocodazolo nucleazione allungamento

47 MICROTUBULE ORGANIZING CENTER MTOC

48 MICROTUBULE ORGANIZING CENTER MTOC

49 Nei siti intracitoplasmatici, dove i microtubuli vengono assemblati in quantità cospicue, è possibile identificare del materiale elettron-denso più o meno struttrato, che costituisce siti specializzati nell’organizzazione dei microtubuli, detti: centri cellulari di organizzazione dei microtubuli (MTOC). Ne esistono 4 tipi principali: Complesso ad anello di  -tubulina CENTRI CELLULARI DI ORGANIZZAZIONE DEI MICROTUBULI (MTOC): MICROTUBULI (MTOC): 1.CENTRI CELLULARI (o centrosomi o materiale pericentriolare) addensamenti di materiale elettron- denso situati nelle vicinanze del nucleo, organizzano i microtubuli citoplasmatici e i microtubuli del fuso mitotico che da questo si estendono in una conformazione “astrale”, a stella. Un centrosoma è composto da una matrice del centrosoma fibrosa che contiene più di 50 copie di  -TuRC

50 Immersa nel centrosoma si trova una coppia di strutture cilindriche disposte ad angolo retto fra loro; questi sono i 2. CENTRIOLI (o corpi basali) da cui prendono origine i microtubuli dei flagelli eucariotici; i centrioli organizzano la matrice del centrosoma assicurando la sua duplicazione durante ciascun ciclo, quando si duplicano i centrioli stessi. Un centriolo è un corto cilindro di microtubuli modificati con un elevato numero di proteine accessorie. Altre strutture appartenenti alla classe dei MTOCsono: 3. CINETOCORI, strutture lamellari poste sulla superficie dei cromosomi, alle quali aderiscono i microtubuli del fuso mitotico 4. CORPI POLARI DEL FUSO, dense strutture a lamelle sovrapposte dalle quali prendono origine i microtubuli del fuso mitotico di molte cellule fungine.

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53 The interior of each centriole appears empty, except for a "cartwheel" structure at one end. Electron micrographs show appendages that protrude from the outer surface at one end of a mature centriole, & fibrous structures connecting the two centriole cylinders. Centrioles are cylindrical structures, usually found in pairs orientated at right angles to one another. The wall of each centriole cylinder is made of nine interconnected triplet microtubules, arranged as a pinwheel.

54 Additional tubulins, designated  as well as other proteins, are either present in centrioles or required for their formation. There is some variability in composition among different organisms. Centriolar microtubules are relatively stable. The  tubulin heterodimers present in centriolar triplet microtubules are modified by polyglutamylation.

55 During centriole duplication prior to mitosis (G 1 - S phase), the two centriole cylinders separate, and a daughter centriole grows from a short disk-like structure at right angles to each parent centriole.

56 The centrosome, a mass of protein also called the microtubule organizing center (MTOC) or pericentriolar material, surrounds centrioles in animal cells. Following duplication, the pericentriolar material initially is associated only with each parent centriole cylinder.

57 Labeling studies have shown such proteins to be located at one end and along lateral margins of the centriolar cylinder, forming a mass the shape of a tube. Proteins present in the pericentriolar material or on the surface of centrioles include centrin, pericentrin, ninein, cenexin, CEP110, CEP250 (C-Nap1),  -tubulin, and others.

58  -Tubulin, which is homologous to  &  tubulins, nucleates microtubule assembly within the centrosome. Several (12-14) copies of  -tubulin associate in a complex with other proteins called “grips” (gamma ring proteins). This  -tubulin ring complex is seen by EM to have an open ring- like structure resembling a lock washer, capped on one side.

59 Polymerization at the minus end of these microtubules is inhibited. Grip proteins of the cap may be involved in mediating binding to the centrosome. Phosphorylation of a conserved tyrosine residue of  -tubulin has been shown to regulate microtubule nucleation in yeast cells. WebsiteWebsite with micrographs & diagrams. Microtubules nucleated by the  -tubulin ring complex appear capped at one end, assumed from other data to be the minus end.

60  -tubulina  - TuRC (Tubulin Ring Complex)

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62 PROTEINE MOTRICI Motori molecolari che si associano ad un filamento del citoscheletro e usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per muoversi in modo costante lungo di essi diverse per il filamento a cui si attaccano, per la direzione in cui si muovono e per il cargo che portano possono trasportare organelli (es mitocondri), fanno scivolare i filamenti del citoscheletro l’uno sull’altro si associano ai filamenti del citoscheletro tramite un dominio motore che si lega all’ATP e lo idrolizza dopo aver svolto l’azione motoria possono staccarsi dal filamento.