Costituisce uno strumento estremamente potente per la creazione e l’analisi Costituisce uno strumento estremamente potente per la creazione e l’analisi.

Presentazione sul tema: "Costituisce uno strumento estremamente potente per la creazione e l’analisi Costituisce uno strumento estremamente potente per la creazione e l’analisi."— Transcript della presentazione:

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2 Costituisce uno strumento estremamente potente per la creazione e l’analisi Costituisce uno strumento estremamente potente per la creazione e l’analisi di ampi archivi molecolari di peptidi, proteine e molecole anticorpali di ampi archivi molecolari di peptidi, proteine e molecole anticorpali La metodologia consiste nell’esposizione di molecole estranee nella loro La metodologia consiste nell’esposizione di molecole estranee nella loro conformazione nativa sulla superficie di un batteriofago conformazione nativa sulla superficie di un batteriofago Ciò è ottenuto grazie alla fusione tra la sequenza di DNA codificante la Ciò è ottenuto grazie alla fusione tra la sequenza di DNA codificante la molecola estranea di interesse ed il gene codificante una delle proteine del molecola estranea di interesse ed il gene codificante una delle proteine del rivestimento fagico rivestimento fagico La metodologia ha consentito la selezione di proteine, peptidi ed anticorpi La metodologia ha consentito la selezione di proteine, peptidi ed anticorpi dotati di specifiche proprietà di legame, a partire da ampi repertori di tali dotati di specifiche proprietà di legame, a partire da ampi repertori di tali molecole molecole 2

3 3 La disponibilità di ampi repertori di varianti molecolari di peptidi o proteine riveste un’importanza fondamentale nell’isolamento di nuove specie molecolari dotate di funzioni biologiche di interesse o di specifiche proprietà di riconoscimento e di legame

4 Numerosi tipi di fagi sono stati adoperati, tra i quali i fagi filamentosi Numerosi tipi di fagi sono stati adoperati, tra i quali i fagi filamentosi Ff, λ e T7 Ff, λ e T7 I fagi della famiglia Ff (M13, Fd ed Fl) hanno proprietà che li rendono I fagi della famiglia Ff (M13, Fd ed Fl) hanno proprietà che li rendono dei vettori di clonaggio eccellenti dei vettori di clonaggio eccellenti E’ possibile inserire nel loro genoma sequenze anche estese di DNA E’ possibile inserire nel loro genoma sequenze anche estese di DNA Inoltre il loro meccanismo di propagazione non litico assicura la Inoltre il loro meccanismo di propagazione non litico assicura la continua propagazione delle particelle fagiche infettanti, in seguito al continua propagazione delle particelle fagiche infettanti, in seguito al loro assemblaggio all’interno del batterio ospite loro assemblaggio all’interno del batterio ospite 4

5 Il genoma di lambda è una molecola lineare a doppio filamento di 48 kbp. Le estremità 5’ e 3’ presentano 12 basi a singolo filamento chiamate estremità cos, che sono complementari tra loro e permettono la circolarizzazione del DNA del fago ʎ dopo l’infezione della cellula ospite. 5

6 Fasi del ciclo litico 1. Adsorbimento 2. Iniezione dell’acido nucleico 3. Fase replicativa precoce 4. Replicazione del genoma virale 5. Sintesi delle proteine capsidiche 6. Assemblaggio del capside e impacchettamento del genoma virale 7. Rilascio dei virus maturi (lisi) 1. Adsorbimento 2. Iniezione dell’acido nucleico 3. Fase replicativa precoce 4. Replicazione del genoma virale 5. Sintesi delle proteine capsidiche 6. Assemblaggio del capside e impacchettamento del genoma virale 7. Rilascio dei virus maturi (lisi) 6

7 7 Un’estremità della particella fagica si adsorbe al pilo F ed il DNA del fago entra nel batterio Il DNA a singolo filamento viene convertito in DNA a doppia elica (forma replicativa, RF) mediante la sintesi di un’elica di DNA complementare (elica -), ad opera della DNA polimerasi batterica Il DNA a singolo filamento viene convertito in DNA a doppia elica (forma replicativa, RF) mediante la sintesi di un’elica di DNA complementare (elica -), ad opera della DNA polimerasi batterica La forma RF del genoma fagico viene moltiplicata rapidamente, fino a che nella cellula batterica sono presenti circa 100 molecole RF La forma RF del genoma fagico viene moltiplicata rapidamente, fino a che nella cellula batterica sono presenti circa 100 molecole RF La trascrizione dei geni virali determina la produzione delle proteine richieste per l’assemblaggio di nuove particelle virali La trascrizione dei geni virali determina la produzione delle proteine richieste per l’assemblaggio di nuove particelle virali La produzione di una proteina virale che lega il DNA a singolo filamento forza la replicazione asimmetrica della forma RF La produzione di una proteina virale che lega il DNA a singolo filamento forza la replicazione asimmetrica della forma RF Questo fa sì che solo un filamento del DNA virale (l’elica +) sia sintetizzata Questo fa sì che solo un filamento del DNA virale (l’elica +) sia sintetizzata Le molecole di DNA a singolo filamento sono assemblate in nuove particelle virali e vengono rilasciate dalla cellula, senza che vi sia lisi cellulare Le molecole di DNA a singolo filamento sono assemblate in nuove particelle virali e vengono rilasciate dalla cellula, senza che vi sia lisi cellulare

8 Il batteriofago M13 è stato il più adoperato ai fini della creazione di archivi di varianti molecolari. Tale particella fagica è rivestita da 2.700 copie della principale proteina di rivestimento (pVIII) e da cinque copie di ciascuna delle quattro proteine di rivestimento minori (pVII, pIX, pIII, pVI). Il fago contiene un DNA circolare, a singola elica, di 6.407 basi, ed è in grado di tollerare l’inserimento nel suo genoma di sequenze estranee, di lunghezza fino a 12.000 basi. 8

9 Tutte le proteine del capside del virione fagico sono state fuse a molecole Tutte le proteine del capside del virione fagico sono state fuse a molecole estranee, ai fini dell’esposizione di queste ultime sulla superficie della estranee, ai fini dell’esposizione di queste ultime sulla superficie della particella fagica particella fagica La scelta della proteina di rivestimento più adatta è dettata dagli La scelta della proteina di rivestimento più adatta è dettata dagli obiettivi dell’analisi obiettivi dell’analisi L’utilizzo di pVIII e la conseguente esposizione di 2.700 copie di molecola L’utilizzo di pVIII e la conseguente esposizione di 2.700 copie di molecola estranea per particella fagica è più utile in quei casi in cui si desideri estranea per particella fagica è più utile in quei casi in cui si desideri identificare molecole dotate di bassa affinità per il bersaglio di interesse identificare molecole dotate di bassa affinità per il bersaglio di interesse L’utilizzo di pIII e la conseguente esposizione di 5 copie di molecola L’utilizzo di pIII e la conseguente esposizione di 5 copie di molecola estranea per particella fagica è preferibile in quei casi in cui si desideri estranea per particella fagica è preferibile in quei casi in cui si desideri selezionare molecole dotate di elevata affinità per il bersaglio selezionare molecole dotate di elevata affinità per il bersaglio 9

10 Phage display of peptides 10

11 In alcuni casi può accadere che la funzionalità della proteina di rivestimento In alcuni casi può accadere che la funzionalità della proteina di rivestimento scelta e dunque la sopravvivenza del fago siano compromesse dall’assenza scelta e dunque la sopravvivenza del fago siano compromesse dall’assenza di versioni parentali della proteina di rivestimento di versioni parentali della proteina di rivestimento In tali casi è preferibile generare particelle fagiche ibride, il cui genoma In tali casi è preferibile generare particelle fagiche ibride, il cui genoma contenga sia una copia del gene codificante la proteina di rivestimento contenga sia una copia del gene codificante la proteina di rivestimento parentale, sia una copia del gene codificante la proteina di fusione parentale, sia una copia del gene codificante la proteina di fusione In alternativa la sequenza codificante la proteina di fusione può essere In alternativa la sequenza codificante la proteina di fusione può essere clonata in un vettore fagmidico clonata in un vettore fagmidico I batteri contenenti il fagmide sono infettati con un fago helper, difettivo ed I batteri contenenti il fagmide sono infettati con un fago helper, difettivo ed incapace di assemblarsi in maniera indipendente incapace di assemblarsi in maniera indipendente Ciò determinerà la generazione di particelle fagiche contenenti sia il fagmide Ciò determinerà la generazione di particelle fagiche contenenti sia il fagmide codificante la proteina di fusione sia il gene del fago helper codificante la codificante la proteina di fusione sia il gene del fago helper codificante la proteina di rivestimento nella sua versione parentale proteina di rivestimento nella sua versione parentale La presenza nel fagmide di un segnale di assemblaggio completamente La presenza nel fagmide di un segnale di assemblaggio completamente funzionale, assente nel genoma del fago helper, fa sì che esso sia funzionale, assente nel genoma del fago helper, fa sì che esso sia preferenzialmente inglobato nelle particelle fagiche mature preferenzialmente inglobato nelle particelle fagiche mature 11

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13 13 All’inizio degli anni ‘80 si stabilì che l’origine di replicazione f1 poteva essere clonata in un plasmide per ottenere la produzione di DNA a singola elica All’inizio degli anni ‘80 si stabilì che l’origine di replicazione f1 poteva essere clonata in un plasmide per ottenere la produzione di DNA a singola elica L’origine di replicazione f1 non era sufficiente per dirigere la produzione di DNA a singolo filamento, ma se un batterio contenente un fagmide veniva infettato con un fago helper, si otteneva la produzione di DNA a singola elica L’origine di replicazione f1 non era sufficiente per dirigere la produzione di DNA a singolo filamento, ma se un batterio contenente un fagmide veniva infettato con un fago helper, si otteneva la produzione di DNA a singola elica Il DNA fagmidico a singolo filamento era assemblato in particelle virali e secreto nel mezzo circostante Il DNA fagmidico a singolo filamento era assemblato in particelle virali e secreto nel mezzo circostante I fagmidi hanno il vantaggio che, in assenza del fago helper, è possibile isolarne il DNA a doppio filamento come se fosse un plasmide I fagmidi hanno il vantaggio che, in assenza del fago helper, è possibile isolarne il DNA a doppio filamento come se fosse un plasmide

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15 Collezione di fagi dell’archivio 15

16 La tripletta amber codifica un codone di terminazione della traduzione UGA La tripletta amber codifica un codone di terminazione della traduzione UGA Nei ceppi di E.coli soppressori esiste un tRNA che riconosce tale tripletta Nei ceppi di E.coli soppressori esiste un tRNA che riconosce tale tripletta come codificante come codificante A causa della scarsità del tRNA, la soppressione non è assoluta e si assesta A causa della scarsità del tRNA, la soppressione non è assoluta e si assesta intorno al 75% del totale dei trascritti intorno al 75% del totale dei trascritti Una parte rilevante della traduzione del costrutto non si arresterà in Una parte rilevante della traduzione del costrutto non si arresterà in corrispondenza del codone amber e sarà prodotta la proteina di fusione corrispondenza del codone amber e sarà prodotta la proteina di fusione In ceppi di E.coli non soppressori la traduzione si arresterà a livello del In ceppi di E.coli non soppressori la traduzione si arresterà a livello del codone amber generando la sola proteina di interesse solubile codone amber generando la sola proteina di interesse solubile 16

17 Una delle applicazioni di maggiore successo della tecnologia del phage display è rappresentata dalla costruzione di ampie collezioni di varianti di molecole anticorpali, le quali “mimano” la variabilità del sistema immunitario animale In particolar modo, è stata descritta la creazione di ampi archivi di scFvs (single chain variable fragments) Tali agenti costituiscono le più piccole porzioni anticorpali ancora in grado di legare l’antigene Essi sono composti dai domini variabili delle catene leggere e pesanti delle immunoglobuline, connessi da un oligopeptide flessibile Ai fini della creazione degli archivi fagici, le molecole anticorpali sono generalmente fuse all’estremità N-terminale della proteina del rivestimento fagico pIII 17

18 anticorpo Fc scFv VHVL 18

19 Gli archivi di molecole anticorpali sono generalmente creati mediante una combinazione casuale delle sequenze codificanti le regione variabili delle catente pesanti e leggere delle immunoglobuline Nel caso degli archivi anticorpali semisintetici, le sequenze codificanti tali regioni variabili sono amplificate a partire dal genoma dei linfociti B di organismi non immunizzati e sono arrangiate in maniera casuale Gli archivi anticorpali sintetici sono invece costruiti interamente in vitro, mediante un approccio di mutagenesi per PCR che prevede l’inserimento di mutazioni casuali nelle sequenze codificanti le regioni che determinano la complementarietà (CDR) 19

20 20 Le regioni CDR, definite anse ipervariabili, sono proprio quelle deputate al riconoscimento dell’antigene In particolare, la regione che determina la complementarietà 3 (CDR3) di entrambe le catene delle immunoglobuline svolge un ruolo di fondamentale importanza nel legame all’antigene, ciò che la ha resa il bersaglio preferito degli eventi di mutagenesi La costruzione di archivi anticorpali sintetici contenenti 10 7 -10 10 cloni ha consentito l’isolamento di molecole anticorpali dotate di elevata affinità

21 Ai fini della creazione degli archivi di sequenze nucleotidiche codificanti forme varianti delle molecole di interesse sono generalmente adoperati approcci di mutagenesi “random”, i quali consentono l’inserimento di mutazioni casuali nelle sequenze codificanti le molecole in questione 21

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23 Le dimensioni del genoma del fago M13 non sono fisse, dunque può essere introdotto DNA estraneo senza compromettere la vitalità del essere introdotto DNA estraneo senza compromettere la vitalità del fago fago La lunghezza della particella fagica varia in base alla quantità di DNA La lunghezza della particella fagica varia in base alla quantità di DNA che contiene che contiene Tale caratteristica è estremamente vantaggiosa ai fini del clonaggio di sequenze di DNA di interesse di sequenze di DNA di interesse 23 Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 kb Il fago M13 è in grado di tollerare l’inserimento nel suo genoma di sequenze estranee, di lunghezza fino a 12.000 basi

24 Realizzata la costruzione dell’archivio fagico, il passaggio successivo è costituito dalla sua analisi e dalla selezione delle particelle fagiche dotate delle proprietà di legame desiderate 24

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26 Incubazione delle particelle fagiche dell’archivio con il bersaglio di interesse Generalmente le molecole bersaglio sono immobilizzate su un supporto solido ed esposte ai fagi Generalmente le molecole bersaglio sono immobilizzate su un supporto solido ed esposte ai fagi Diversi approcci sperimentali sono stati adoperati con successo, tra questi l’immobilizazione delle molecole bersaglio su piastra, in colonna o sulla superficie di sfere magnetiche Diversi approcci sperimentali sono stati adoperati con successo, tra questi l’immobilizazione delle molecole bersaglio su piastra, in colonna o sulla superficie di sfere magnetiche Tali strategie possono risultare inappropriate se si desidera selezionare molecole in grado di riconoscere la conformazione del bersaglio legata alla sua funzionalità Tali strategie possono risultare inappropriate se si desidera selezionare molecole in grado di riconoscere la conformazione del bersaglio legata alla sua funzionalità In tali casi è preferibile adoperare metodologie più innovative, le quali prevedono l’utilizzo di cellule integre, fissate o viventi, o di sezioni di tessuto In tali casi è preferibile adoperare metodologie più innovative, le quali prevedono l’utilizzo di cellule integre, fissate o viventi, o di sezioni di tessuto 26

27 Lavaggio eseguito per rimuovere le particelle fagiche che non presentano le proprietà di legame desiderate Eluizione delle particelle fagiche legate al bersaglio Amplificazione dei fagi selezionati mediante infezione di ceppi batterici ospiti 27

28 La procedura è definita di biopanning Idealmente un unico ciclo di selezione dovrebbe essere sufficiente, ma nella pratica il legame aspecifico dei fagi rende necessaria l’esecuzione di più cicli (da tre a sei) Idealmente un unico ciclo di selezione dovrebbe essere sufficiente, ma nella pratica il legame aspecifico dei fagi rende necessaria l’esecuzione di più cicli (da tre a sei) Al fine di preservare le molecole dotate di minore affinità per il bersaglio, si preferisce eseguire i cicli iniziali in condizioni di bassa stringenza (alta concentrazione dell’antigene, brevi tempi di lavaggio) Al fine di preservare le molecole dotate di minore affinità per il bersaglio, si preferisce eseguire i cicli iniziali in condizioni di bassa stringenza (alta concentrazione dell’antigene, brevi tempi di lavaggio) La stringenza è poi incrementata in maniera progressiva con il procedere dei cicli di biopanning La stringenza è poi incrementata in maniera progressiva con il procedere dei cicli di biopanning 28

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30 Al termine di ogni ciclo di selezione, la caratterizzazione delle proprietà di legame delle molecole selezionate è eseguita adoperando metodi di analisi rapidi e sensibili Al termine di ogni ciclo di selezione, la caratterizzazione delle proprietà di legame delle molecole selezionate è eseguita adoperando metodi di analisi rapidi e sensibili Tra questi molto utilizzato è il saggio immunologico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Tra questi molto utilizzato è il saggio immunologico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 30

31 31  Il saggio ELISA combina la specificità del legame (ad es. anticorpo-antigene) e la sensibilità dei dosaggi enzimatici la sensibilità dei dosaggi enzimatici  Sfrutta la capacità di superfici di plastica di adsorbire quantità piccole, ma rilevabili di proteina rilevabili di proteina  In alternativa è possibile piastrare cellule che esprimono un dato antigene ad elevati livelli ad elevati livelli APPLICAZIONI:  Analisi di routine per l’identificazione di molecole terapeutiche promettenti  Analisi della presenza di tossine nel cibo

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34 Al termine dei cicli di biopanning, l’identità dei cloni selezionati può essere determinata sia mediante sequenziamento, sia mediante ibridazione con arrays di acidi nucleici 34

35 35 Isolamento di anticorpi da utilizzare per molteplici applicazioni Reagenti immunologici Reagenti immunologici Applicazioni cliniche Applicazioni cliniche Anticorpi dotati di attività catalitica Anticorpi dotati di attività catalitica

36 36 Sono stati costruiti archivi di peptidi Sequenze substrato di enzimi Sequenze substrato di enzimi Sequenze utili come antigeni per lo sviluppo di vaccini Sequenze utili come antigeni per lo sviluppo di vaccini Identificazione della specificità di legame di una data proteina Identificazione della specificità di legame di una data proteina

37 Le applicazioni della tecnologia del phage display sono innumerevoli Gli archivi fagici sono considerati una fonte quasi illimitata di peptidi, proteine ed anticorpi in grado di riconoscere in maniera specifica un dato bersaglio Nel 2002 è stato isolato un scFv umano specifico per il recettore ErbB2 Nel 2002 è stato isolato un scFv umano specifico per il recettore ErbB2 a partire da un ampio archivio fagico → tale recettore costituisce un a partire da un ampio archivio fagico → tale recettore costituisce un ottimo bersaglio tumorale, dal momento che è espresso ad elevati ottimo bersaglio tumorale, dal momento che è espresso ad elevati livelli nei tumori della mammella, dell’ovario e del polmone, mentre nei livelli nei tumori della mammella, dell’ovario e del polmone, mentre nei tessuti normali è espresso a bassi livelli e solo in alcuni tipi di cellule tessuti normali è espresso a bassi livelli e solo in alcuni tipi di cellule epiteliali epiteliali 37

38 PHAGE SELECTION STRATEGY BINDING SELECTION BY FACS S-ERBICIN PH-ERBICIN SKBR3 A431 ErbB2 38

39 BINDING OF ERBICIN TO ErbB2 + / - CELLS A431 SKBR3 K D ~ 4 nM 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 39

40  Specifically recognizes ErbB2 on target cells  Is efficiently internalized ERBICIN Hence, it is a promising immunoagent for diagnosis and therapy of certain carcinomas 40

41 41 Nel 2004 è stato isolato, a partire da un ampio archivio fagico, un scFv Nel 2004 è stato isolato, a partire da un ampio archivio fagico, un scFv specifico per la glicoproteina-P, la cui espressione ad elevati livelli specifico per la glicoproteina-P, la cui espressione ad elevati livelli nelle cellule tumorali è responsabile dell’insorgenza del fenotipo di nelle cellule tumorali è responsabile dell’insorgenza del fenotipo di resistenza ai trattamenti anticancro convenzionali resistenza ai trattamenti anticancro convenzionali Nel 2005 sono stati isolati, a partire da un ampio archivio fagico, Nel 2005 sono stati isolati, a partire da un ampio archivio fagico, peptidi in grado di legare in maniera specifica un’ampia varietà di peptidi in grado di legare in maniera specifica un’ampia varietà di bersagli, tra cui il peptide β-amiloide, il quale svolge un ruolo bersagli, tra cui il peptide β-amiloide, il quale svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’Alzheimer fondamentale nella patogenesi dell’Alzheimer Ulteriori esempi…

42 E’ stato descritto l’isolamento, a partire da ampi archivi fagici, di peptidi in E’ stato descritto l’isolamento, a partire da ampi archivi fagici, di peptidi in grado di legare un ampio spettro di materiali inorganici e nanostrutture grado di legare un ampio spettro di materiali inorganici e nanostrutture La struttura lunga e sottile delle particelle fagiche che espongono i peptidi La struttura lunga e sottile delle particelle fagiche che espongono i peptidi ha suggerito il loro utilizzo come stampo per la costruzione di ha suggerito il loro utilizzo come stampo per la costruzione di nanoconduttori e nanofibre nanoconduttori e nanofibre Particelle fagiche, esprimenti sulla loro superficie peptidi in grado di legare Particelle fagiche, esprimenti sulla loro superficie peptidi in grado di legare l’argento, sono risultate in grado di indurre la formazione di nanocristalli di l’argento, sono risultate in grado di indurre la formazione di nanocristalli di argento, a partire da una soluzione di nitrato di argento argento, a partire da una soluzione di nitrato di argento 42

43 43 Sono stati inoltre sviluppati approcci alternativi al phage display basati sull’utilizzo non di fagi, ma di cellule batteriche o di lievito, oppure procedure interamente in vitro che consentono la produzione di proteine legate ai rispettivi mRNA (ribosome display o mRNA display). In tutti i casi è realizzato il collegamento diretto tra genotipo e fenotipo, caratteristico delle tecnologie “display”.

44 44 Ribosome display: consente l’isolamento di singole proteine da ampi archivi generati mediante PCR. La metodologia consiste nell’espressione di costrutti in cui è stato rimosso il codone di stop, ciò che determina la formazione di complessi proteina-ribosoma-mRNA (PRM) in cui il polipeptide nascente è collegato al suo mRNA codificante. La selezione è effettuata sulla base dell’affinità per un ligando immobilizzato. L’mRNA selezionato può essere amplificato mediante PCR. mRNA display: consiste nella generazione in vitro di molecole ibride RNA-DNA mediante legame chimico dell’estremità 3’ dell’mRNA ad una breve sequenza oligonucleotidica di ssDNA che trasporta l’antibiotico puromicina. Nel corso della sintesi proteica il ribosoma rallenta a livello della giunzione RNA-DNA e la molecola di puromicina entra nel sito dell’enzima peptidil transferasi, instaurando un legame covalente con la catena polipeptidica nascente.